RABATT

Apr 20, 2024

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12383 (2023) Diesen Artikel zitieren

949 Zugriffe

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

In Kollagen-I-Matrizen eingebettete mehrzellige Tumorsphäroide sind gängige In-vitro-Systeme für die Untersuchung solider Tumoren, die die physiologische Umgebung und die Komplexität der In-vivo-Umgebung widerspiegeln. Während Kollagen-I-Umgebungen physiologisch relevant sind und eine Zellinvasion zulassen, stellt die Untersuchung von Sphäroiden in solchen Hydrogelen Herausforderungen für wichtige analytische Tests und eine Vielzahl bildgebender Verfahren dar. Während dies größtenteils auf die Dicke der 3D-Hydrogele zurückzuführen ist, die bei anderen Proben typischerweise durch Schneiden überwunden werden kann, ist das Schneiden von Kollagen-I-Hydrogeln aufgrund ihrer hochporösen Beschaffenheit sehr schwierig, insbesondere auf eine Weise, die das Hydrogelnetzwerk einschließlich der Zelle bewahrt Invasionsmuster. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode zur Vorbereitung und Kryosektion invasiver Sphäroide in einer Zweikomponentenmatrix (Kollagen I und Gelatine), eine Technik, die wir als Dual-Hydrogel-In-vitro-Sphäroid-Kryosektion dreidimensionaler Proben (DISC-3D) bezeichnen. DISC-3D erfordert keine Zellfixierung, bewahrt die Architektur invasiver Sphäroide und ihrer Umgebung, eliminiert Bildgebungsprobleme und ermöglicht die Verwendung von Techniken, die bei der dreidimensionalen Sphäroidanalyse selten angewendet wurden, einschließlich hochauflösender Mikroskopie und Massenspektrometrie-Bildgebung .

Die In-vitro-Untersuchung von Zellen, die auf flachen, zweidimensionalen (2D) Substraten kultiviert werden, wird seit über einem Jahrhundert eingesetzt und war für unzählige wissenschaftliche Entdeckungen von entscheidender Bedeutung. Während die 2D-Zellkultur nach wie vor eine Standardmethode in der Molekular- und Zellbiologie ist, ist es seit langem bekannt, dass sie kritische Aspekte von In-vivo-Systemen, einschließlich dreidimensionaler (3D) Zell-Zell- und Zell-Umwelt-Interaktionen, nicht rekapitulieren kann1. Solche Wechselwirkungen sind besonders wichtig bei der Untersuchung zellulärer Prozesse, die explizit entstehend und vielzellig sind; zum Beispiel bei der Entwicklung und dem Wachstum und Fortschreiten solider Tumoren.

In den letzten Jahren wurde zunehmend die 3D-Zellkultur eingesetzt2. Hier werden mehrzellige Einheiten aus Zelllinien oder Patientengewebe gezüchtet oder präpariert – üblicherweise als Sphäroide bzw. Organoide bezeichnet – und in synthetischen oder natürlichen Hydrogelen kultiviert, die die extrazelluläre In-vivo-Matrix nachahmen. Es hat sich gezeigt, dass dreidimensionale Zellkulturen die Physiologie menschlichen Gewebes besser nachbilden, wie z. B. Nährstoff- und Sauerstoffgradienten, unterschiedliche Proliferationszonen sowie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen, was klare Gründe für die Verwendung von 3D-Kulturen zur Untersuchung biologischer Fragestellungen liefert vielzelliger Natur3,4,5,6. Unter den 3D-Hydrogelen sind Kollagen-I-Umgebungen für viele solide Tumoren von besonderer physiologischer Bedeutung. Bei Brustkrebs ist eine hohe Kollagen-I-Dichte ein bekannter Risikofaktor für die Entwicklung einer Erkrankung7,8 und eine besondere Dichte und räumliche Organisation der Kollagenfasern um Tumore herum sind mit der Prognose verbunden9. Wechselwirkungen zwischen Zellen und der kollagenreichen Stroma-Mikroumgebung sind auch bei Bauchspeicheldrüsenkrebs wichtig10,11 und wurden mit einer Vielzahl anderer Krebsarten in Verbindung gebracht12. Kollagen I ist auch eine attraktive Umgebung für die 3D-Zellkultur, da seine Biochemie und Netzwerkstruktur eine effiziente Zellinvasion unterstützen. Darüber hinaus handelt es sich um eine Umgebung, in der physikalische Eigenschaften wie Faserbreite, Porengröße und Hydrogelsteifigkeit ohne Änderung der biochemischen Zusammensetzung leicht angepasst werden können, was die Untersuchung der Auswirkungen dieser Eigenschaften auf den zellinvasiven Modus und die Effizienz ermöglicht13,14,15,16 .

Obwohl allgemein anerkannt ist, dass 3D-Zellkulturen und insbesondere Kollagen-I-Hydrogele ein hohes Maß an physiologischer Relevanz und Möglichkeiten bieten, die Bedeutung der Biochemie von physikalischen Eigenschaften für das Zellverhalten zu trennen, ist die Akzeptanz von 3D-Zellkulturen vergleichsweise gering langsam. Die Zurückhaltung ist zum Teil auf die Herausforderungen zurückzuführen, die mit der Aufnahme hochauflösender optischer Mikroskopiebilder in solchen Umgebungen verbunden sind6. Zellen spüren die Steifheit der Umgebung und reagieren darauf über Entfernungen von mindestens zehn und wohl weit über hundert Mikrometern17. Damit sich Zellen wie in einer isotropen 3D-Umgebung verhalten, müssen sie deutlich über den steifen Bildsubstraten positioniert werden. Dies kann dazu führen, dass sich Zellen außerhalb des Arbeitsabstands typischer Objektive mit hoher numerischer Apertur befinden, dass das Hintergrundsignal aufgrund von Streuung von außerhalb der Bildebene stark ist und dass Zellen oder das die Zellen umgebende Hydrogel autofluoreszieren. Darüber hinaus kann die 3D-Umgebung die Diffusion kleiner Moleküle oder Antikörper durch die Probe behindern, was sowohl Arzneimittelstudien als auch die Einführung fluoreszierender Markierungen in diesem Zusammenhang behindert. Die mit 3D-Proben verbundenen Herausforderungen können bei den informationsintensivsten Ansätzen besonders akut sein, wie z. B. der hochauflösenden optischen Bildgebung, bei der ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis von größter Bedeutung ist, korrelativen Ansätzen, bei denen mehrere Modalitäten eingesetzt werden, und nicht-optischen Ansätzen wie der Massenspektrometrie Bildgebung, bei der Streuung von dicken Proben die Datenerfassung außer an der Probenoberfläche verhindert.

Wie bei Gewebe können auch bei 3D-Hydrogelproben Schnitte durchgeführt werden, um diese Probleme zu lindern. Leider sind einige der gleichen Eigenschaften, die Kollagen I für die Zellinvasion zulassen, auch schlecht für die Sektionierung geeignet. Insbesondere Kollagen-I-Gele sind schwach, mit Speichermodulen von typischerweise 10–100 Pa für Präparate, die für Zellinvasionsexperimente verwendet werden13,14. Zusammen mit der mikroporösen Beschaffenheit von Kollagen-I-Hydrogel-Netzwerken führt dies dazu, dass die Gele beim Schneiden besonders leicht kollabieren. Der Nachweis des Schneidens zelltragender 3D-Kollagen-I-Hydrogele ist selten18,19, obwohl das Schneiden von Sphäroidkernen (ohne invasionsfähige Matrix) möglich ist20,21,22,23. Die Untersuchung von Sphäroidkernen ist zwar informativ, schließt jedoch eine Untersuchung der Zellmigrationsmuster, der Zellinteraktionen mit extrazellulären Matrixproteinen und der mit der Migration von Krebszellen verbundenen Metastasenkaskaden aus. Darüber hinaus können typische Einbettungsmittel für bestimmte Experimente eine Herausforderung darstellen. Das Einbetten von Paraffin beeinflusst die Proteinantigenität, indem es die antikörperbasierte Markierung24,25 hemmt und gleichzeitig eine Dehydrierung der Probe erfordert, die die Struktur des Hydrogelnetzwerks stört. Die Einbettung in eine optische Schneidtemperaturverbindung (OCT) führt zu leicht zu schneidenden Proben19,26, ist jedoch mit Massenspektrometrieexperimenten nicht kompatibel, da einer der Hauptbestandteile von OCT, Polyethylenglykol, Ionen produziert, die mit endogenen kleinen Molekülionen konkurrieren, was zu einer erheblichen Verringerung führt Spektrumintensität und -qualität27,28. Darüber hinaus beruhten die Schnittmethoden, die zuvor bei Zellen mit einer invasionsfähigen Matrix18,19 verwendet wurden, auf der Zellfixierung, die eine Vielzahl analytischer Ansätze, einschließlich der massenspektrometrischen Bildgebung von Lipiden und verwandter Lipidomics-Analysen, beeinträchtigt, da Fixierungsprotokolle ausgewaschen werden entfernt mehrere kleine Metaboliten und Lipide29,30,31.

Hier beschreiben wir eine neuartige Methode zur Vorbereitung und Kryosektion von Sphäroiden in einer Zweikomponentenmatrix – Kollagen I und Gelatine – eine Technik, die wir als Dual-Hydrogel-In-vitro-Sphäroid-Kryosektion von dreidimensionalen Proben (DISC-3D) bezeichnen. Diese Technik macht sich die Tatsache zunutze, dass die Gelierung von Kollagen I bei steigender Temperatur erfolgt, während die von Gelatine bei sinkender Temperatur erfolgt, was eine serielle temperaturgesteuerte Gelierung der sich gegenseitig durchdringenden Netzwerke ermöglicht. Das DISC-3D-Protokoll unterstützt die Zellproliferation und -invasion, und die Integrität einzelner Zellen und der umgebenden extrazellulären Matrix bleibt während des Schnitts erhalten. Darüber hinaus beeinträchtigt das Protokoll die Proteinantigenität nicht und erfordert keine Fixierung (obwohl es damit kompatibel ist), was die Untersuchung von Lipidverteilungen in invasiven Zellen ermöglicht. Somit ermöglicht das DISC-3D-Protokoll nicht nur eine Reihe optischer Mikroskopien, einschließlich hochauflösender Mikroskopien, sondern auch die massenspektrometrische Bildgebung invasiver Sphäroide.

Wie in Abb. 1 und Abb. S1 schematisch dargestellt, besteht das DISC-3D-Protokoll darin, ein Sphäroid zu formen, es in eine Kollagen-I-Lösung zu legen, die um das Sphäroid geliert ist, das Sphäroid eindringen zu lassen und es mit einer Gelatine zu überziehen Lösung, die vor der Gelierung der Gelatine durch die Probe diffundiert. Dadurch entsteht ein duales, sich gegenseitig durchdringendes Kollagen I/Gelatine-Hydrogel-Netzwerk um das Sphäroid. Zu diesem Zeitpunkt sind die Proben zum Einfrieren und Kryoschneiden bereit.

DISC-3D-Protokoll. Sphäroide werden in Gegenwart von fluoreszierend markierten Polystyrolkügelchen gebildet, die einen visuellen Hinweis für die Lokalisierung von Sphäroiden in späteren Schritten bieten. Sphäroide werden in Kollagen-I-Lösungen gegeben, die gelieren. Nach der Sphäroidimplantation und der ersten Zellinvasion werden die Proben mit erwärmter Gelatine überschichtet. Während die Zellen weiter eindringen, lässt man die Gelatine 24 Stunden lang durch die Probe diffundieren und wird dann vor dem Schockgefrieren 1 Stunde lang bei 4 °C geliert. Die Probe kann dann mit verschiedenen Techniken kryogeschnitten und abgebildet werden. Für verschiedene Experimente optimierte Variationen des Verfahrens werden in den Methoden und in Abb. S1 beschrieben. Ein repräsentatives Sphäroid, das dem DISC-3D-Protokoll unterzogen und mittels Hellfeldmikroskopie abgebildet wurde, ist in Abb. S2b,c an den beiden Punkten im Protokoll dargestellt, die in blauen Kästchen dargestellt sind.

Die Kombination von Kollagen I und Gelatine ist aus mehreren Gründen besonders reizvoll. Erstens handelt es sich bei Gelatine um denaturiertes Kollagen, wodurch sichergestellt wird, dass die Zellen einer der einfachsten biochemischen Umgebungen ausgesetzt sind, die bei einem solchen Ansatz möglich sind. Entscheidend ist, dass Kollagen beim Erhitzen einen Sol-Gel-Übergang durchläuft, während Gelatine beim Abkühlen einen Sol-Gel-Übergang durchläuft. Dies ermöglicht eine serielle Selbstorganisation der beiden Netzwerke bei Temperaturänderungen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Gelatine in gelöster Form keinen Einfluss auf die Zellinvasion hat (Abb. S2), so dass der Zeitpunkt der Gelatinezugabe und die Zeit, die für ihre Diffusion durch die Probe erforderlich ist, die Untersuchung der Invasion und der eingedrungenen Zellen nicht behindern. Schließlich befasst sich das DISC-3D-Protokoll mit der Notwendigkeit eines bifunktionalen Gerüsts mit zwei unterschiedlichen Porengrößen. Während sich Kollagen I selbst zu Fasern mit Porengrößen in der Größenordnung von Mikrometern anordnet, einer Netzwerkstruktur, die die Zellinvasion stark unterstützt, bildet Gelatine ein nanoporöses Netzwerk. Die nanoporöse Gelatine verleiht der Matrix im Gegensatz zu einem (einkomponentigen) hochporösen Kollagen-I-Hydrogel physikalische Eigenschaften, die für Kryoschnitte geeignet sind. Da die Kryosektion von Sphäroiden, einschließlich invasiver Sphäroide, möglich ist, ermöglicht das DISC-3D-Protokoll eine Reihe von Experimenten, die für solche Proben bisher nicht möglich waren. Während Abb. 1 eine Implementierung des DISC-3D-Protokolls zeigt, kann das Protokoll an unterschiedliche experimentelle Anforderungen angepasst werden. Beispiele hierfür sind in „Methoden“ beschrieben und in Abb. S1 schematisch dargestellt.

Die zunehmende Komplexität der 3D-Kultur stellt einzigartige Herausforderungen für die empfindliche Erkennung und Quantifizierung interessierender zellulärer Ziele dar. In einer so überfüllten Umgebung kann der Nachweis von Zielantigenen durch die Diffusionsfähigkeit der Sonde durch dichte Zellregionen und die umgebende extrazelluläre Matrix sowie durch Signalverlust aufgrund der Lichtstreuung von dickeren Proben eingeschränkt sein. Während traditionelle eingebettete Schnitte dieses Problem lindern können, sind keine vorhandenen Techniken für das gesamte Spektrum optischer und massenspektrometrischer Bildgebungsexperimente geeignet, die wir durchführen möchten. Das DISC-3D-Protokoll nutzt unter anderem die überlegene Antigenkonservierung von Kryoschnittmethoden gegenüber paraffinbasierten Ansätzen, um Bildgebungstechniken mit hohem Gehalt und hoher Auflösung zu ermöglichen, die bei 3D-Proben typischerweise eine Herausforderung darstellen. Dies wird zunächst in Abb. 2 veranschaulicht, die ein einzelnes MDA-MB-231-Brustkrebs-Sphäroid zeigt, das mit dem DISC-3D-Protokoll hergestellt und (vor der Invasion) mit Phalloidin fixiert und gefärbt wurde – AlexaFluor567 (ein kleines, fluoreszierend konjugiertes Molekül, das bindet). zu zellulärem f-Aktin), DAPI (ein kleines fluoreszierendes Molekül, das in die DNA interkaliert) und ein direkt konjugierter Anti-β1-Integrin-Antikörper (Klon P5D2), markiert mit AlexaFluor488. Der mit diesem Experiment verbundene Arbeitsablauf ist in Abb. S1b dargestellt. Optische Bilder dieses Sphäroids wurden zunächst vor der Zugabe von Gelatine und dem Kryoschnitt erstellt (Abb. 2a – c, obere Reihe), um einen Vergleich der Bildqualität vor und nach dem Schnitt zu ermöglichen. Alle 10 μm wurden Bilder entlang der axialen Dimension des intakten Sphäroids aufgenommen, und alle 100 μm werden repräsentative Bilder des Sphäroids gezeigt. Diese Bilder (Abb. 2a – c, obere Reihe) und die zugehörigen Intensitätsprofile, die aus linearen ROIs erhalten wurden, die über die Mitte jedes Sphäroidkerns gezeichnet wurden (Abb. 2d – f), zeigen, dass alle drei Fluorophore an der Sphäroidperipherie sichtbar sind Mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie sind keine im Sphäroidkern zu sehen. Dies ist besonders bemerkenswert im Fall von DAPI, das eine gleichmäßige Verteilung im Sphäroid aufweisen sollte. Die offensichtliche Lokalisierung von DAPI an der Sphäroidperipherie weist auf eine begrenzte Diffusion des Farbstoffs durch das Sphäroid und/oder einen Signalverlust aufgrund einer ineffizienten Anregung und/oder Sammlung von Fluoreszenz aus dem Sphäroidkern hin. Um diesen Schwierigkeiten entgegenzuwirken, wurde dieses Sphäroid den letzten Schritten des DISC-3D-Protokolls unterzogen, was zu Schnitten mit einer Dicke von 10 μm führte. Die Bildgebung nach dem Schnitt zeigt Fluoreszenz durch die gesamte axiale Dimension des Sphäroids sowie über die radiale Dimension, obwohl bei einigen Farbstoffen immer noch eine erhöhte Intensität an der Peripherie des Sphäroids beobachtet wird, was besonders in Schnitten deutlich wird, die tief im Inneren des Sphäroids gewonnen wurden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass das Fehlen eines Innensignals in 3D-Proben, die mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet wurden, teilweise auf den Verlust des Fluoreszenzsignals aufgrund von Lichtstreuung zurückzuführen ist, teilweise aber auch auf eine schlechte Penetration der Fluoreszenzmarkierungen durch die dichte 3D-Probe zurückzuführen ist. Daher wurde dasselbe Sphäroid, das bereits das vollständige DISC-3D-Verfahren einschließlich Kryoschnitten durchlaufen hatte, mit jedem dieser Farbstoffe erneut gefärbt und abgebildet (Abb. 2a–c, untere Reihe). Diese Bilder zeigen eine relativ gleichmäßige Färbung von DAPI über das Sphäroid in der xy-Ebene für alle Schnitte (Abb. 2j). Daraus kann geschlossen werden, dass konfokale Fluoreszenzbilder, die vom ursprünglichen Sphäroid erhalten wurden, durch Einschränkungen in der Bildtiefe, Streuung der Anregung und/oder Emission in der Probe sowie Probenpermeabilität und Farbstoffdiffusion beeinflusst wurden. Bilder von markiertem Phalloidin in den erneut gefärbten Proben zeigen auch eine relativ gleichmäßige Färbung im gesamten Sphäroid (Abb. 2k), was mit der Erwartung übereinstimmt, dass F-Actin in allen Zellen in ähnlichen Mengen vorhanden ist. Abbildung 2n zeigt, dass es keinen statistischen Unterschied zwischen den anfänglichen DISC-3D-Phalloidin-Bildern und den erneut gefärbten DISC-3D-Phalloidin-Bildern gibt, was darauf hindeutet, dass Phalloidin – anders als DAPI – die Probe im 3D-Kontext vollständig durchdrang.

Vergleich der Bildqualität in lateraler und axialer Dimension. Alle Daten hier wurden von demselben MDA-MB-231-Sphäroid erhalten, das gemäß dem in Abb. S1b dargestellten DISC-3D-Protokoll hergestellt und mit DAPI (blau), Phalloidin (rot) und Anti-β1-Integrin-Antikörper fluoreszierend markiert wurde (Grün). (ac) Sphäroidbilder, aufgenommen (obere Reihe) mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie in 3D, (mittlere Reihe) nach dem DISC-3D-Protokoll einschließlich Kryoschnitten (10 μm-Scheiben) und (untere Reihe) nach erneuter Färbung nach dem DISC-3D-Protokoll . Beschriftungen geben die Tiefe im Sphäroid an, in der das Bild aufgenommen wurde. Die obere Reihe von ac zeigt nur Schnitte bei 100 und 200 μm, da der Arbeitsabstand des Objektivs eine Abbildung tiefer in die Probe unmöglich machte. Maßstabsbalken = 200 μm. (d–j) Intensitätsprofile eines linearen ROI, gezeichnet von einem Rand des Sphäroids zum anderen [gelbe Linie im Sphäroid oben links in (a)] für alle in (a–c) gezeigten Bilder, wobei 3D-Bilder dargestellt sind in (d–f), DISC-3D-Kryoschnittdaten dargestellt in (g–i) und DISC-3D-neugefärbte Daten dargestellt in (j–l). Die Intensität wird auf die maximale Intensität in diesem Intensitätsprofil normalisiert. (m–o) Signal gemittelt über normalisierte Intensitätsprofile und Schnitte über das Sphäroid in erneut gefärbten 3D-, DISC-3D- und DISC-3D-Proben für (m) DAPI, (n) Phalloidin bzw. (o) β1-Integrin. Wir stellen fest, dass ein solcher Vergleich den Unterschied zwischen herkömmlichen 3D- und DISC-3D-Bildern unterbewertet, da die herkömmlichen 3D-Bilder nur 100 und 200 μm in der Probe beurteilt werden. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, †p > 0,05 (n = 12, 59 und 46 Schichten für 3D, DISC-3D bzw. DISC-3D erneut gefärbt).

Antikörperbasierte Sonden leiden unter ähnlichen Problemen bei der Probenpenetration wie ihre niedermolekularen Gegenstücke. Die Färbung von β1-Integrin zeigt eine starke Anreicherung dieses Proteins an der Sphäroidperipherie in 3D- und DISC-3D-Bildern (Abb. 2c, obere zwei Reihen), was auf eine schlechte Antikörperpenetration hinweist. Obwohl man hohe Konzentrationen von β1-Integrinen an der Kollagen-Sphäroid-Grenzfläche erwarten könnte, haben frühere Arbeiten gezeigt, dass β1-Integrine auch an extrazellulären Matrix-vermittelten Zell-Zell-Adhäsionen im gesamten Inneren des Sphäroids beteiligt sind32,33. Tatsächlich zeigt eine erneute Färbung von DISC-3D-Proben, dass dies wahr ist, da sich im gesamten Sphäroidkern β1-Integrin befindet (Abb. 2c, untere Reihe; Abb. 2l, o). Die in Abb. 2 gezeigte Ergebnisreihe zeigt, wie das DISC-3D-Protokoll, insbesondere in Verbindung mit der Färbung nach dem Schneiden, kritische, aber ansonsten verdeckte Details der Molekülverteilung in einer Probe aufdecken kann, die falsch interpretiert werden könnten, wenn man sich nur über Färbung und/oder Analyse nähert. oder Bildgebung in 3D. Angesichts der hier beobachteten Unterschiede in der Effizienz der Sondenpenetration (bei der eine schlechte Penetration offenbar nicht nur bei sperrigeren Sonden auftritt) ist außerdem klar, dass es schwierig sein kann, Situationen vorherzusagen, in denen Probleme mit der Farbstoffpenetration auftreten werden, was den Nutzen des DISC-Systems unterstreicht. 3D-Protokoll mit anschließender Färbung zur korrekten Identifizierung der Molekülverteilung in 3D-Proben.

Neben der Verbesserung der Bildqualität fluoreszierend markierter 3D-Proben erleichtert das DISC-3D-Protokoll die Verwendung von Fluoreszenzmarkierungsstrategien, die in typischen 3D-In-vitro-Proben aufgrund des begrenzten Signals, des geringen Signal-Hintergrund-Verhältnisses und/oder unpraktisch oder gar nicht durchführbar sind schlechte Probenpenetration. Viele direkt konjugierte Antikörper und sogar die gelegentliche Fluorophormarkierung mit kleinen Molekülen fallen in diese Gruppe; Darüber hinaus schlägt die sekundäre Antikörpermarkierung bei Sphäroiden, die in 3D-Hydrogelen kultiviert wurden, fast immer fehl. Obwohl es einige Berichte über die Verwendung sekundärer Antikörper in geschnittenen 3D-Proben gibt, erfordern die verwendeten Methoden Dehydrierungs-, Fixierungs- und Einbettungsschritte, die normalerweise nicht die Integrität der invasiven Vorderseite eines Sphäroids bewahren34,35.

Hier wurden Sphäroide mit drei Farbstoffen angefärbt, die regelmäßig in 2D-Zellkulturen verwendet werden, in unserem Labor jedoch nicht erfolgreich an 3D-Sphäroidproben eingesetzt wurden und für die wir in der Literatur keine Hinweise auf eine erfolgreiche Markierung in 3D-Proben finden, die eine Zellinvasion unterstützen. Insbesondere haben wir versucht, MT1-MMP, RhoA und p53 durch direkt konjugierte Antikörper (MT1-MMP) oder eine Kombination aus primären und fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern (RhoA und p53) in Zellen an der invasiven Vorderseite eines Sphäroids sichtbar zu machen. Bei MT1-MMP besteht die Hauptschwierigkeit vermutlich in den geringen Mengen des vorhandenen Zielproteins und seiner Lage in der Nähe oder in der extrazellulären Umgebung, wo das Hintergrundsignal besonders hoch sein kann. Für RhoA und p53 wurde eine sekundäre Markierung versucht. Die Sekundärmarkierung ist ein praktischer Ansatz in Fällen, in denen direkt konjugierte Antikörper nicht im Handel erhältlich sind, und bietet eine wertvolle Signalverstärkung für Ziele mit geringer Häufigkeit. Hier besteht die größte Herausforderung in der zweistufigen Natur der Sekundärmarkierung, die eine effektive serielle Penetration zweier großer Moleküle durch die Probe erfordert. Wie Abb. 3b–d zeigt, weisen Bilder, die mit diesen Farbstoffen in 3D-Ansätzen erhalten wurden, ein niedriges Signal-Hintergrund-Verhältnis auf, während Bilder, die durch Färbung nach Schnitten mit dem DISC-3D-Protokoll erhalten wurden, ein deutlich höheres Signal-Hintergrund-Verhältnis aufweisen (Abb. 3f–k). Wir stellen außerdem fest, dass der Phänotyp invasiver Zellen in DISC-3D-Proben erhalten bleibt, was nach unserem besten Wissen bisher nur einmal für invasive Zellen in einem 3D-Hydrogel nach der Sektionierung nachgewiesen wurde19.

DISC-3D verbessert die Auflösung und genaue Lokalisierung. (a–h) Invasive MDA-MB-231-Sphäroide, abgebildet mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (a–d) in 3D oder (e–h) nach DISC-3D-Präparation (10 μm-Scheiben). (a,e) Beispielhafte Sphäroide, markiert mit DAPI (cyan) und mit Kollagen, das ich auch fluoreszierend markiert habe (grün). Es wurden Bilder einzelner Zellen an der Vorderkante der invasiven Sphäroidfront aufgenommen, wie in den weißen Kästchen sowie in den Feldern (b–d) und (f–h) dargestellt. (b–d, f–h) Repräsentative eindringende Zellen aus Sphäroiden, markiert mit DAPI (Cyan) und (b,f) Anti-RhoA (rot, sekundär), (c,g) Anti-p53 (Magenta, sekundär) oder (d,h) Anti-MT1-MMP-Antikörper (grün, direkt konjugiert). In allen Fällen wurden Bilder einzelner Zellen an der Vorderkante der invasiven Sphäroidfront aufgenommen, wie sie beispielsweise durch die weißen Kästchen in (a, e) hervorgehoben sind. (a,e) Standardbilder der konfokalen Mikroskopie; (b–d, f–h) sind Airyscan-Bilder. (i–k) Signal-Hintergrund-Verhältnis der 3D- und DISC-3D-Proben, gekennzeichnet für (i) RhoA, (j) p53 und (k) MT1-MMP. Für MT1-MMP wurde das Signal-Hintergrund-Verhältnis sowohl auf der Zellmembran als auch in der unmittelbaren Umgebung der Zelle, wo MT1-MMP ausgeschieden wird, beurteilt. Maßstabsbalken = 200 μm in (a,e) und 10 μm in (b–d, f–h); *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, †p > 0,05.

Wichtig ist, dass die konfokale Mikroskopie von DISC-3D-Sphäroiden Molekülverteilungen zeigt, die mit den in der Literatur berichteten übereinstimmen, während dies bei konfokalen Bildern intakter 3D-Proben nicht der Fall ist. Beispielsweise muss RhoA an der Zellmembran verankert werden, um aktiviert zu werden, und daher ist zu erwarten, dass es hauptsächlich in der Membran lokalisiert ist, insbesondere in eindringenden Zellen36,37. Aufgrund des schlechten Signal-Hintergrund-Signals in Zellen, die im 3D-Hydrogel gefärbt und mit einem herkömmlichen konfokalen Ansatz abgebildet wurden, liegt die RhoA-Intensität kaum über dem Hintergrund (Abb. 3d), und die Lokalisierung des Fluorophors ist anhand dieser Bilder schwer zu bestimmen. Im Gegensatz dazu zeigen invasive Zellen, die nach dem DISC-3D-Protokoll visualisiert wurden, eine klare Lokalisierung von RhoA auf der Zellmembran (Abb. 3f). Ebenso bindet p53 direkt an DNA und ist daher voraussichtlich hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, wie routinemäßig in 2D-Proben nachgewiesen wurde38. Das herkömmliche 3D-Bild zeigt diese Lokalisierung nicht (Abb. 3c), während DISC-3D-Proben zeigen, dass das Protein auf den Zellkern beschränkt ist (Abb. 3g). Schließlich existiert MT1-MMP sowohl als Transmembran- als auch als ausgeschiedenes, lösliches Protein39,40. Im herkömmlichen 3D-Bild ist in der extrazellulären Umgebung kein Protein zu erkennen, und selbst die Lokalisierung des Farbstoffs innerhalb der Zelle ist aufgrund des geringen Signal-Hintergrund-Verhältnisses schwierig zu bestimmen (Abb. 3d). Im Gegensatz dazu ist die MT1-MMP-Lokalisierung an der Membran und in der lokalen Umgebung invasiver Zellen in Proben offensichtlich, die über das DISC-3D-Protokoll vorbereitet wurden (Abb. 3h).

Angesichts der Möglichkeit, DISC-3D-Proben nach Kryoschnitten zu färben und abzubilden, haben wir auch den Zeitraum bewertet, über den Färbung und Bildgebung mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden können. Um die Haltbarkeit der Probe zu beurteilen, haben wir durch Fixieren, Einfrieren, Kryoschneiden und Färben ein Sphäroid hergestellt. Anschließend wurde die Probe über 10 Monate lang bei 4 °C in einen luftdichten Beutel mit Trockenmittel gegeben. Nach der Lagerung wurde die Probe 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einen Exsikkator gegeben und dann abgebildet (Abb. S3). Die Probe zeigte keine erkennbare Verschlechterung und die Signalintensität und die Lokalisierung des Fluorophors entsprachen den Erwartungen. Darüber hinaus wurde der Probe nach der 10-monatigen Lagerung ein zusätzlicher Farbstoff (Phalloidin) zugesetzt, um zu beurteilen, ob eine Markierung nach längerer Lagerung erreicht werden konnte. Abbildung S3 zeigt, dass eine solche Markierung zur Visualisierung von Aktin in der Probe geeignet ist, was auf die langfristige Erhaltung der zellulären und subzellulären Struktur in auf diese Weise vorbereiteten Proben hinweist. Die Möglichkeit, Proben nach dem DISC-3D-Protokoll zu färben und langfristig zu lagern, ermöglicht eine anschließende Probenabfrage, beispielsweise nach der Entwicklung neuer Hypothesen und der Identifizierung neuer Markierungsziele.

Ein wesentlicher Bestandteil der DISC-3D-Methode ist die Erhaltung der Grundarchitektur des Gerüsts, in das die Zellen eingebettet sind. Obwohl Kontrollexperimente zeigen, dass das interpenetrierende Gelatine-Kollagen-Netzwerk die Zellinvasion in einer Weise unterstützt, die mit reinen Kollagen-I-Gelen vergleichbar ist (Abb. S2), haben wir die Struktur von DISC-3D-geschnittenen Hydrogelen mittels optischer Mikroskopie weiter untersucht, um zu bestätigen, dass das Kollagen Das Fasernetzwerk, dessen fibrilläre, mikroporöse Struktur für die Zellinvasion von entscheidender Bedeutung ist, blieb nach der Probenverarbeitung und -aufteilung intakt. Um die Analyse des fibrillären Netzwerks zu vereinfachen, verwendeten wir bloße (sphäroidfreie) Hydrogele aus Kollagen I und Gelatine, die gemäß dem DISC-3D-Protokoll hergestellt wurden. Über die Validierung der Netzwerkstruktur hinaus stellten diese Messungen auch eine praktische Testumgebung für die Bewertung der Bildqualität von 3D- und DISC-3D-Proben in verschiedenen optischen Mikroskopietechniken dar, da die unter den hier verwendeten Bedingungen gebildeten Kollagenfasern einen ziemlich einheitlichen Durchmesser von 50–100 nm haben15 .

Abbildung 4a zeigt repräsentative Bilder von Kollagen unter Verwendung von fünf Fluoreszenzmikroskopietechniken: Weitfeld, konfokale Mikroskopie, Airyscan-Mikroskopie, Gitterstrukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) und stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM). Die letzten drei Ansätze gelten als Super-Resolution-Techniken: Airyscan-Bildgebung verbessert die Auflösung über einen Multielementdetektor und Entfaltung, Lattice-SIM stellt hochauflösende Informationen mithilfe eines Beugungsgitters wieder her und STORM ist eine auf Lokalisierung basierende Super-Resolution-Technik Dies verbessert die Auflösung durch sequentielle Abbildung einzelner Fluorophore41,42,43. Die STORM-Mikroskopie wurde mit hoch geneigter und laminierter optischer Blattbeleuchtung (HILO) durchgeführt, einer Variante der Totalreflexionsmikroskopie, die die Eindringtiefe erhöht44.

(a) Bilder von Kollagen I, aufgenommen (oben) in 3D ≈ 10 μm über dem Deckglas [3D niedrig], (Mitte) in 3D > 100 μm in das Gel [3D hoch] und (unten) nach der DISC-3D-Vorbereitung (4 μm-Scheiben). Von links nach rechts zeigen die Spalten Bilder, die mit Weitfeldmikroskopie, konfokaler Mikroskopie, Airyscan-Bildgebung, Gitter-SIM und STORM in einer HILO-Implementierung aufgenommen wurden. Für die 3D-STORM-Bildgebung wird in den oberen beiden Reihen kein Bild angezeigt, da (3D niedrig) die Filterung von Licht außerhalb der Ebene unzureichend war oder (3D hoch) die Technik in solchen Tiefen nicht implementiert werden konnte. Maßstabsbalken = 20 μm. (b) Mittelwert der gemessenen Halbwertsbreite (FWHM) der Kollagenfasern aus jeder Mikroskopietechnik. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Die erwartete minimale FWHM jedes Ansatzes wird durch gestrichelte horizontale Linien angezeigt. (c) Porengröße von Kollagennetzwerken, bestimmt über bildgebende Verfahren und Probenvorbereitungen (Einzelheiten siehe Methoden). Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Statistische Signifikanz, Anzahl der untersuchten Proben und zusätzliche Informationen zur Auflösung jeder Technik sind in Abb. S4 dargestellt.

Für jede Technik wurden Bilder von Kollagenfasern in der Nähe des Substrats (10–25 μm im Gel, als 3D niedrig, obere Reihe bezeichnet) und deutlich oberhalb des Substrats (> 100 μm im Gel, als 3D hoch bezeichnet) aufgenommen. mittlere Reihe) und anschließende DISC-3D-Vorbereitung und Kryoschnitt (untere Reihe). Alle untersuchten Gele wurden dem ersten Teil des DISC-3D-Protokolls unterzogen, der Zugabe und Gelierung von Gelatine. Daher besteht der einzige Unterschied zwischen den Proben in den DISC-3D-Bildern (untere Reihe) und den anderen Proben (obere und mittlere Reihe) darin, dass die DISC-3D-Proben eingefroren, aus den Probenvertiefungen entnommen und geschnitten wurden. Zunächst stellen wir fest, dass Bilder des in der Nähe des Deckglases gesammelten Hydrogels qualitativ den Bildern von DISC-3D-Proben aller Techniken ähneln, was darauf hindeutet, dass die Hydrogelstruktur durch das DISC-3D-Probenvorbereitungsverfahren nicht negativ beeinflusst wird. Im Allgemeinen zeigen DISC-3D-Proben eine Verbesserung der Bildqualität bei allen untersuchten Mikroskopietechniken. Die Weitfeldmikroskopie, die bei 3D-Proben unter Signalen außerhalb der Ebene leidet, zeigt deutliche Verbesserungen der Bildqualität bei DISC-3D-Proben im Vergleich zu intakten 3D-Proben (Abb. 4a, Spalte ganz links). Konfokale Mikroskopie, Airyscan und SIM liefern zwar eine hervorragende Bildqualität und zeigen eine konsistente Fasermorphologie im unteren Bereich des Gels, zeigen jedoch auch eine Verschlechterung der Bildqualität bei zunehmenden Bildgebungstiefen (Abb. 4a). Wir stellen fest, dass die Bildgebung in solchen Tiefen sicherstellt, dass die befragten Zellen das darunter liegende steife Substrat nicht wahrnehmen. Daher ist die Maximierung der Bildqualität in diesem Bereich von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung des Zellverhaltens in einem physiologisch relevanten Kontext. Die STORM-Bilder waren schlecht und es war schwierig, sowohl niedrige als auch hohe Fasern in den 3D-Gelen zu erkennen, was angeblich auf Schwierigkeiten beim Herausfiltern der ebenen Emission in dieser stark streuenden Probe zurückzuführen war, da eine solche Filterung für die Identifizierung und Lokalisierung einzelner Fluorophore von entscheidender Bedeutung ist. Die bei DISC-3D-Proben beobachtete Verbesserung der Bildqualität öffnet die Tür zur Offenlegung von Details über die Systemmikrostruktur, die sonst in herkömmlichen 3D-Kulturkontexten nicht zugänglich wären.

Tatsächlich haben wir im Anschluss an eine solche qualitative Bewertung sowohl die scheinbare Faserbreite als auch die Porengröße über alle Probenvorbereitungen und -techniken hinweg quantifiziert, da dies die wichtigsten Netzwerkstruktureigenschaften von Kollagen-I-Hydrogelen sind45. Die scheinbare Faserbreite wurde aus der Halbwertsbreite (FWHM) der Gaußschen Anpassungen an Intensitätsprofile über die Fasern hinweg bestimmt, wobei nur Fasern berücksichtigt wurden, die mit dieser Methode gut angepasst wurden (R2 > 0,95, Abb. S4a). Bei den meisten hier untersuchten Mikroskopietechniken finden wir Faserbreiten, die größer als die erwartete Faserdicke von 50–100 nm sind, was mit den gemessenen Auflösungen dieser Techniken übereinstimmt (Abb. 4, Abb. S4c). Da die tatsächliche Faserbreite unter den gemessenen Auflösungen für Weitfeld, Konfokal, Airyscan und SIM liegt, kann nur die STORM-Bildgebung – die nur auf DISC-3D-Proben angewendet werden kann – die Faserdicke genau angeben (Abb. 4b). Hier finden wir in DISC-3D-Proben eine Faserbreite von etwa 75 nm, was gut mit Messungen durch Elektronenmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie übereinstimmt46.

Als nächstes bewerteten wir die Porengrößen von Hydrogelen über bildgebende Methoden und Probenvorbereitungen hinweg, wie unter Methoden beschrieben. Bei 3D-Proben war die gemessene Porengröße in allen Bildgebungskontexten, in denen die Bildgebung erfolgreich war, ähnlich und ergab einen Wert von ≈ 4 μm (Abb. 4c). Diese Porengröße ähnelt der zuvor anhand der Fluoreszenzmikroskopie47 berichteten und ist etwas kleiner als die zuvor für Kollagen-I-Gele dieser Konzentration und biologischen Quelle berichtete13; Diese Messungen wurden jedoch mittels konfokaler Reflexionsmikroskopie durchgeführt, die gegenüber einer Teilmenge der Fasern unempfindlich ist48, was zu einem scheinbar weniger dichten Netzwerk führt. Mit DISC-3D vorbereitete Proben ergaben bei gleicher Analyse etwas kleinere Porengrößen als ihre 3D-Gel-Gegenstücke mit einer Porengröße von ≈ 3 μm (Abb. 4c). Die Unterschiede in der Porengrößenverteilung und die Tatsache, dass die Fasern auf den DISC-3D-Bildern etwas stärker gekrümmt und verwickelt aussehen als auf anderen Bildern, können auf einen geringfügigen Kollaps zurückzuführen sein, der mit der Probenmanipulation verbunden ist, die zur Vorbereitung der Probe für das Schneiden und/oder erforderlich ist die Aufteilung selbst. Insbesondere haben wir festgestellt, dass beim Einfrieren keine Veränderungen an der Probenstruktur auftreten. Kleinere Veränderungen treten jedoch beim Entfernen der die Probe umgebenden Silikonabstandshalter auf, was vor dem Kryoschneiden erfolgen muss (Abb. S5). Durch das Entfernen der Silikonabstandshalter können die Verankerungspunkte des probenumspannenden Kollagennetzwerks gestört werden, was zu einer geringfügigen Kontraktion und zum Zusammenbruch des Gels führt. Während des Schneidens kann es zu zusätzlichen Störungen kommen. Trotz dieser kleinen Unterschiede behalten DISC-3D-Proben eindeutig die mikroporöse Struktur von 3D-Kollagennetzwerken bei, was die Gewissheit gibt, dass detaillierte, hochauflösende Abbildungen von Zell-extrazellulären Matrix-Wechselwirkungen und Änderungen in der lokalen Netzwerkstruktur während der Invasion über bildgebende DISC-3D-Proben erfasst werden können. 3D-Beispiele.

Nachdem wir gezeigt haben, dass die Netzwerkstruktur und die optische Zugänglichkeit von DISC-3D-Proben erhalten bleiben, bewerten wir nun ihre Eignung für eine weitere leistungsstarke Analysemethode, die Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI). Während die MSI von Sphäroidkernen erfolgreich demonstriert wurde, konnte bislang noch keine derartige Charakterisierung der invasiven Front eines Sphäroids erreicht werden20. Ein entscheidendes Problem bei der MSI-Erstellung von DISC-3D-präparierten Proben ist die geringe Zelldichte an der Sphäroid-Invasionsfront, die wiederum zu einer geringen Konzentration der interessierenden Moleküle in dieser Region führt. Um diese Herausforderung zu meistern, wurden ein leistungsstarker, modifizierter Prototyp eines Sprühgeräts und eine neuartige beheizte Transferkapillare eingesetzt (Abb. S6a), die die Erfassung von MSI-Daten ermöglichte, wobei die Transferkapillare auf Temperaturen von Raumtemperatur bis 400 °C eingestellt war. Abbildung 5a–c zeigt die durchschnittliche Signalintensität über einen Sphäroidabschnitt im Bereich von 200–1000 m/z (Abb. 5a) und zwei Teilmengen dieses Bereichs, den Bereich 300–500 m/z (Abb. 5b) und den Bereich 700 – 900 m/z-Region (Abb. 5c). Wenn die Temperatur auf 350 °C ansteigt, nimmt das Gesamtsignal erheblich zu, ein Trend, der sich fortsetzt, wenn die Temperatur auf 400 °C ansteigt. Zwischen 350 und 400 °C kommt es jedoch auch zu einem deutlichen Anstieg des Signals im Bereich von 300–500 m/z. Zusammen mit der Tatsache, dass die Signalintensität bei 400 °C im Bereich von 700–900 m/z abnimmt, lässt dies auf eine Fragmentierung von Lipiden und Proteinen schließen. Im Gegensatz dazu ist das Signal bei 350 °C im Bereich von 700–900 m/z maximal, wo mehrere Lipidunterklassen – darunter die meisten Triacylglycerine und Phosphatidylcholine – Signatursignale aufweisen49,50. Dies deutet darauf hin, dass 350 °C die ideale Temperatur für die Erfassung von MSI-Daten auf Sphäroidschnitten ist, die über das DISC-3D-Protokoll hergestellt wurden, und wir haben in diesen Schnitten bei dieser Temperatur mehrere Lipidklassen nachgewiesen, darunter freie Fettsäuren, Phospholipide, Sphingolipide und Glycerolipide. Dies wird außerdem durch zwei spezifische Phosphatidylglycerol (PG)-Lipidionen gestützt, die bei m/z = 773,5338 (PG 36:2) und m/z = 747,5182 (PG 34:1) nachgewiesen wurden und von denen berichtet wurde, dass sie bei Brustkrebs signifikant verändert sind51 ,52. Diese Signale sind nicht nur von höherer Intensität, sondern ihr Vorhandensein in der gesamten invasiven Front ist bei 350 °C im Vergleich zu jeder anderen Temperatur am deutlichsten (Abb. S6c, d). Beispielhafte Spektren mit Schwerpunkt auf dem 700–900 m/z-Bereich, gesammelt bei 24 °C und 350 °C, sind in Abb. 5d, e dargestellt, und beispielhafte Spektren des gesamten m/z-Bereichs bei jeder der untersuchten Temperaturen sind in Abb. dargestellt . S6e.

Massenspektrometrie-Bildgebung von DISC-3D-Proben (10 μm-Scheiben) von MDA-MB-231-Sphäroiden. Durchschnittliche Intensität aus Massenspektrometriesignalen, gemittelt über Sphäroidabschnitte bei verschiedenen Temperaturen über (a) den gesamten Bereich von 200–1000 m/z, (b) den Bereich von 300–500 m/z und (c) den Bereich von 700–900 m/z Reichweite. Die hier gezeigten statistischen Ergebnisse wurden als paarweise Stichproben durchgeführt. Eine vollständige Beschreibung der statistischen Ergebnisse ist in Abb. S6b dargestellt. n = 8 in allen Fällen außer 150 °C, wo n = 7. *p < 0,05, †p > 0,05. (d,e) Repräsentative normalisierte Massenspektren, die von invasiven Sphäroiden nach dem DISC-3D-Protokoll bei (d) 24 °C und (e) 350 °C gesammelt wurden, zeigen den Anstieg der Signalintensität im Bereich von ≈ 650–900 m/z. Die Zahl rechts auf jedem Feld gibt den maximalen Intensitätspeak bei dieser Temperatur an. (f) Repräsentative Massenspektrometriebilder, die nach dem in Abb. S1d dargestellten DISC-3D-Protokoll erstellt wurden und aufeinanderfolgende Abschnitte einzelner Sphäroide für mehrere Signalionen zeigen. Im ersten seriellen Abschnitt jedes Signalions ist der Sphäroidkern durch eine weiße gepunktete Linie markiert und die invasive Front ist durch eine rote gepunktete Linie gekennzeichnet. Rechts ist für Signalionen eine Farbskala von minimaler bis maximaler Intensität dargestellt. Maßstabsbalken = 500 μm.

Unter Verwendung des Prototyps eines beheizten Kapillarröhrchens in Verbindung mit dem DISC-3D-Protokoll haben wir nach unserem besten Wissen die ersten massenspektrometrischen Bilder der Lipidverteilung in in vitro eindringenden Brustkrebszellen erhalten (Abb. 5f). Interessanterweise zeigen diese Bilder räumliche Verteilungen einiger Lipidionen, die nur im Sphäroidkern lokalisiert sind, während andere Lipidionen sowohl im Kern als auch in der invasiven Region vorhanden sind. Beispielsweise haben wir beobachtet, dass freie Fettsäuren wie FA 16:1 (m/z = 253,2190) eine bevorzugte Lokalisierung im Sphäroidkern zeigen, während Phospholipide wie Phosphatidylcholine und ethergebundene Phosphatidylethanolamine (m/z = 778,5570; PE O-40 :5) sind sowohl im gesamten Kern als auch an der invasiven Front vorhanden. Es ist besonders interessant, dass einige Lipidionen, die im gesamten Sphäroid vorkommen, in der invasiven Region am intensivsten sind, obwohl die Zelldichte in dieser Region viel geringer ist als im Kern, was möglicherweise neue lipidomische Signaturen invasiver Zellen offenbart. Hier haben wir Sphingomyelin-Ionen identifiziert [SM 34:1; O2 (m/z = 703,5719), Abb. 5f, untere Reihe und auch SM 40:1; O2 (m/z = 787,6714)], die eine solche Verteilung zeigen, was mit anderen Erkenntnissen übereinstimmt, die den Anstieg von Sphingomyelinen mit hohem Molekulargewicht bei invasiven Krebsarten im Vergleich zu in 3D53 kultivierten präkanzerösen Brustkrebszellen hervorheben.

Korrelative Bildgebung aufeinanderfolgender Scheiben eines invasiven Sphäroids, die mit dem in Abb. S1d dargestellten DISC-3D-Protokoll hergestellt wurden, zeigt (obere Reihe) DAPI, abgebildet mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, (mittlere Reihe) MSI-Signal bei 778,5770 m/z mit linearer Farbskala, dargestellt in das rechte Feld und (untere Reihe) ein korrelatives Bild der konfokalen und MS-Bilder. Maßstabsbalken = 200 μm.

Die DISC-3D-Probenvorbereitung ermöglicht nicht nur eine große Vielfalt optischer Mikroskopie und massenspektrometrischer Bildgebung, sondern erleichtert auch die korrelative Mikroskopie über diese Techniken hinweg. Eine solche instrumentenübergreifende korrelative Mikroskopie stellt bei 3D-Proben aufgrund ihrer Größe und Dimensionalität typischerweise eine große Herausforderung dar, was zu einem sehr großen Suchfeld für identifizierte Regionen von Interesse führt. Während Referenzmarker diese Herausforderungen mildern können, sind nur wenige Referenzmarker sowohl für MSI als auch für die optische Bildgebung geeignet und keiner wurde im Zusammenhang mit invasiven Sphäroiden bewertet54,55. Hier zeigen wir, dass DISC-3D die korrelative Mikroskopie über Instrumente hinweg ohne die Notwendigkeit von Referenzmarkierungen erleichtert, indem der Suchraum effektiv von 3D auf 2D reduziert wird. Abbildung 6 und Abb. S7 zeigen eine Vielzahl korrelativer Bilder, die mit verschiedenen Instrumenten und Techniken aufgenommen wurden. Bemerkenswert ist, dass die Registrierung auch bei einer reinen Hydrogelprobe, die nur wenige Unterscheidungsmerkmale aufweist, ohne Referenzmarker erfolgreich durchgeführt wird (Abb. S7).

Abbildung 6 zeigt, dass eine korrelative Bildgebung von DISC-3D-Proben mit optischen und massenspektrometrischen Bildgebungstechniken durchgeführt werden kann. Diese Abbildung zeigt ein konfokales Bild eines eindringenden Sphäroids mit Zellen, die mit dem Kernfarbstoff DAPI markiert sind, und ein MSI-Bild dieses Sphäroids. Solche korrelativen Bilder helfen bei der Interpretation von MSI-Daten, da die optischen Bilder Zelldichte, -verteilungen und invasive Zonen deutlich erkennen lassen. Tatsächlich könnte dieser Ansatz möglicherweise zur Normalisierung des MSI-Signals als Funktion der Zelldichte verwendet werden, da die Normalisierung bei MSI nach wie vor ein herausforderndes Problem darstellt56,57,58. Wir stellen fest, dass die Markierung von Zellen mit DAPI eine Zellfixierung und -permeabilisierung erfordert, die mit der MSI-Bildgebung nicht kompatibel sind, da die erforderlichen Waschschritte viele interessierende Lipide entfernen. Daher wurde diese Probe gemäß dem in Abb. S1d gezeigten DISC-3D-Protokoll vorbereitet, eine massenspektrometrische Bildgebung durchgeführt und anschließend wurde die Probe fixiert, permeabilisiert und mit DAPI angefärbt, um die optische Bildgebung zu ermöglichen. Dieses Verfahren unterstreicht, dass DISC-3D-Proben weiterhin für eine zusätzliche Charakterisierung nach MSI geeignet sind, was im Allgemeinen als destruktive Technik gilt.

Das DISC-3D-Protokoll ermöglicht die Abfrage invasiver Sphäroidproben mit hoher Auflösung und High-Content-Ansätzen. In diesem Protokoll folgt auf die typische Sphäroidkultur und -invasion die Zugabe einer Gelatinelösung, die vor dem Schockgefrieren und Kryoschneiden durch den Sol-Gel-Übergang geführt wird. Das duale Kollagen- und Gelatine-Hydrogel ist von Natur aus bifunktionell und unterstützt sowohl die Zellinvasion als auch die Kryosektion. Das Schnittverfahren bewahrt das Migrationsmuster eindringender Zellen sowie die Architektur der Kollagenmatrix und ermöglicht die Analyse räumlich heterogener Zellverhaltensweisen und lokaler Veränderungen der Mikrostruktur der extrazellulären Matrix mithilfe verschiedener Techniken. Darüber hinaus erfordert das DISC-3D-Protokoll keine Fixierung oder Zugabe von Komponenten, die die Probenstruktur, die molekulare Verteilung und den molekularen Nachweis verändern könnten. Dies rationalisiert Markierungsstrategien und ermöglicht die Anwendung hochauflösender optischer Bildgebung und Massenspektrometrie-Bildgebung, Techniken, die in der 3D-Zellkultur oder mit etablierten Schnittverfahren, die mit invasiven Sphäroiden kompatibel sind, im Allgemeinen nicht möglich sind.

Insbesondere erleichtert das DISC-3D-Protokoll das Schneiden von 3D-Hydrogelen auf Kollagen-I-Basis, die invasive Sphäroide enthalten, und vermeidet so Herausforderungen im Zusammenhang mit der Markierung und Bildgebung im 3D-Kontext, die nicht nur zu schlechter Bildqualität, sondern auch zu einem falschen Verständnis der molekularen Lokalisierung in a führen können Probe. Beispielsweise haben wir gezeigt, dass die konfokale 3D-Bildgebung zwar auf eine Akkumulation von β1-Integrin an der Sphäroidoberfläche hindeutet (Abb. 2c, obere Reihe), die Bildgebung dieser Proben nach der DISC-3D-Präparation jedoch zeigt, dass diese offensichtliche Integrinakkumulation ein Artefakt war, das durch schlechte Ergebnisse verursacht wurde Diffusion des Antikörpers und hohe Brechungsgrade in den intakten 3D-Proben. Darüber hinaus ermöglicht das DISC-3D-Protokoll eine längere Probenspeicherung vor der Färbung und erleichtert so die erneute Abfrage der Probe, wenn neue Hypothesen auftauchen.

Wir zeigen auch, dass das DISC-3D-Protokoll die fibrilläre, mikroporöse Struktur des Kollagen-I-Hydrogels bewahrt, eine Voraussetzung für die Verwendung bildgebender Ansätze zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix, wie sie bei der Zellinvasion auftreten. Tatsächlich führt das DISC-3D-Protokoll zu einer verbesserten Bildqualität von Kollagenmatrixmerkmalen über eine Reihe optischer Mikroskopietechniken, einschließlich hochauflösender Techniken. Besonders deutlich wird dies tief im Inneren des Gels, wo das In-vitro-3D-System physiologisch am relevantesten ist.

Während die Verbesserungen, die DISC-3D bei der optischen Bildgebung gegenüber der Bildgebung in nativen 3D-Proben mit sich bringt, auffallend sind, bietet das DISC-3D-Protokoll zusätzliche Vorteile im Vergleich zu anderen Schnitttechniken, da die Probenmorphologie im Vergleich zu zuvor etablierten Schnitttechniken gut erhalten bleibt, was besonders wichtig ist angesichts der hochporösen Natur von Kollagenhydrogelen. Entscheidend ist, dass der Ansatz keine Gewebefixierung oder den Einsatz von OCT erfordert, was beides zu veränderten und unterdrückten Lipidsignalen in der Massenspektrometrie beiträgt. Dadurch kann der DISC-3D-Ansatz für die Massenspektrometrie-Bildgebung verwendet werden. Während es sich bei MSI um eine neue, leistungsstarke Technik zur Charakterisierung kleiner Moleküle, Lipide und Proteine ​​in biologischen Proben handelt, beschränkte sie sich bislang weitgehend auf die Untersuchung von Gewebeschnitten. Während frühere Forscher MSI von Sphäroidkernen nachgewiesen haben, ermöglichte keine bestehende Technik die Erhaltung der invasiven Zellmorphologie und lieferte die hohe Massenspektrometrieempfindlichkeit, die zur Charakterisierung der invasiven Front von Sphäroiden erforderlich ist. Wir zeigen, dass das bifunktionale, duale Kollagen-I-Gelatine-Hydrogel, das im DISC-3D-Protokoll von entscheidender Bedeutung ist, sowohl die Zellinvasion in 3D unterstützt als auch Kryoschnitte ermöglicht, während der Sphäroidkern, die invasiven Zellen und die Integrität, Morphologie und Biochemie der umgebenden Matrix erhalten bleiben Kontext. Zusammen mit Modifikationen der MSI-Instrumentierung zur Signalverstärkung demonstrieren wir wiederum die Bildgebung über das Sphäroid und die lokale Messung des Lipidgehalts in invasiven Zellen. Das DISC-3D-Protokoll öffnet somit die Tür zur Lipidomics- und Metabolomics-basierten Bildgebung insbesondere invasiver Zellen und liefert möglicherweise neue Erkenntnisse über die Ursachen und mögliche Behandlungen für die Invasion und Metastasierung von Krebszellen.

HyClone DMEM-L-Glutamin-Medien mit hohem Glucosegehalt und Schweinegelatine Typ A mit einer Blütestärke von 300 wurden von Fisher Scientific (Waltham, MA) bezogen. Fötales Rinderserum und MEM-Lösung nichtessentieller Aminosäuren wurden von Gibco (Waltham, MA) bezogen. Accutase und Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B, 100X, wurden von MP Biomedicals (Solon, OH) gekauft. Mit Pepsin behandeltes (PT) Rinderkollagen vom Typ I wurde von Advanced BioMatrix (San Diego, CA) als Lösung mit 5,9–6,1 mg/ml bezogen. Säurelösliches (AS) Rattenschwanz-Kollagen vom Typ I und Zellwiederherstellungslösung wurden als 10 mg/ml-Lösung von Corning (Corning, NY) bezogen. ATTO 647N-Farbstoff (mit N-Hydroxysuccimid (NHS)-Ester-Funktionalität; λex = 646 nm, λem = 664 nm), Dimethylsulfoxid (DMSO), DAPI, 8 M Harnstoff, Essigsäure (99,7 %) und Poly-L-Lysin Lösung wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) gekauft. Wachstumsfaktorreduziertes, Phenolrot-freies BME/Matrigel wurde als 8,9–12 mg/ml-Lösung von BD Biosciences (San Jose, CA) bezogen. DMEM-Lösung (10x), NaOH (1 N) und Natriumbicarbonatlösung (7,5 %) wurden von Sigma Aldrich gekauft und vor der Verwendung steril filtriert. Gibco 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES)-Puffer (1 M), TetraSpeck-Mikrokügelchen (0,1 µm, fluoreszierend blau/grün/orange/dunkelrot) und FluoroSpheres (carboxylatmodifiziert, 1 µm Nile Red fluoreszierend 2). % Feststoff) wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA) bezogen und vor der Verwendung steril filtriert. Gepuffertes Formalinphosphat (10 %), Rinderserumalbumin (BSA), Wasser (LC-MS-Qualität), Methanol (LC-MS-Qualität) und Ameisensäure (99 %) wurden von Thermo Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) bezogen. Triton-X wurde von EMD Millipore Chemicals (Billerica, MA) bezogen. AlexaFluor488-konjugierte Anti-Integrin-β1-Antikörper (Klon P5D2, Färbung insgesamt β1) und AlexaFluor647-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper wurden von Abcam (Cambridge, MA) erhalten. AlexaFluor 555 NHS-Ester und AlexaFluor-konjugiertes Phalloidin wurden von Molecular Probes von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) bezogen. Der mit MT1-MMP AlexaFluor488 konjugierte Antikörper wurde von R&D Systems (Minneapolis, MN) bezogen. Anti-p53-Antikörper und Anti-RhoA-Antikörper waren ein Geschenk des Labors von Carol Prives (Columbia University, NY). 1 M Tris-HCl-Puffer wurde von Lonza Accugene (Morristown, NJ) gekauft. Das Vectashield-Eindeckmedium wurde von Vector Laboratories (Burlingame, CA) erworben.

Vorgereinigte Objektträger 24 × 75 × 1 mm, Deckglas 24 × 40 und Nunclon Sphera-Platten wurden von Fisher Scientific (Waltham, MA) erworben. Schalen mit hoher Toleranz (P35G-0.170-14-C) wurden von MatTek Corporation (Ashland, MA) bezogen. 35-mm-Fluoroplatten wurden von World Precision Instruments (Sarasota, Florida) bezogen. Silikonkultureinsätze zum Selbsteinsetzen wurden von Idibi (Grafelfing, Deutschland) bezogen.

MDA-MB-231-Brustkrebszellen wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) erhalten. Die Zellen wurden in 1x DMEM mit hohem Glucosegehalt, das 10 % (v/v) fötales Rinderserum, 1 % (v/v) 100x-Antibiotikalösung und 1 % (v/v) 100x-Lösung nicht-essentieller Aminosäuren enthielt, kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid gehalten. Die Zellen wurden subkultiviert, als eine Konfluenz von 80–90 % erreicht war, und ab den Passagen 3–20 verwendet.

Sphäroide wurden unter Verwendung einer Modifikation des zuvor beschriebenen Protokolls erzeugt.32 Insbesondere wurden auf Gewebekulturplastik ausplattierte Zellen mit Accutase abgelöst und in eiskaltes DMEM-Wachstumskulturmedium mit 0,2575 mg/ml Matrigel (Basalmembranextrakt), 1 × 10–, gegeben. 4 % (v/v) Nilrot-Fluorosphären (je nach Bedarf) und 5 × 104 Zellen/ml, was zu Sphäroiden mit jeweils 10.000 Zellen führt. Bei Sphäroiden, die Fluorosphären enthielten, gab es eine anfängliche Zentrifugation, die die Hälfte des Wachstumskulturmediums und die Fluorosphären enthielt. Anschließend wurde das verbleibende Wachstumskulturmedium, das die Zellen und Matrigel enthielt, vorsichtig auf das Wachstumszellkulturmedium, das die Fluorosphären enthielt, pipettiert und die Platte erneut zentrifugiert. In Abwesenheit von Fluorosphären findet nur eine einzige Zentrifugation statt, die alle oben genannten Komponenten enthält. Die Zentrifugation wurde in Nunclon Sphera-Platten mit 96 Vertiefungen und U-Boden mit ultraniedriger Befestigung bei 4 °C und 1000 G für 10 Minuten durchgeführt. Man ließ die Sphäroide 48 Stunden lang bei 37 °C unter 5 % Kohlendioxid verdichten.

Fluoreszenzmarkiertes Kollagen I wurde wie zuvor beschrieben erzeugt.59,60 Kurz gesagt, AS-Rattenschwanzkollagen I wurde zu einer 2 mg/ml-Lösung in steril filtrierter 20 mM Essigsäure und 0,01 M Natriumbicarbonat auf einen pH-Wert von ≈ 8 verdünnt. NHS Ester-modifiziertes AlexaFluor555 wurde der Kollagen-I-Lösung zugesetzt, um das gewünschte Markierungsverhältnis zu erreichen (im Allgemeinen 5 Fluorophore pro Kollagen-I-Monomer), und die Reaktion wurde 24 Stunden lang bei 4 °C im Dunkeln ablaufen gelassen. Die markierte Kollagenlösung wurde dann 3 Tage lang gegen 20 mM Essigsäure dialysiert, um jeglichen ungebundenen Farbstoff zu entfernen. Markiertes Kollagen I wurde bis zu 6 Monate lang im Dunkeln bei 4 °C gelagert.

Kollagengele wurden aus hochkonzentrierter (5,9–6,1 mg/ml) Pepsin-behandelter Kollagenmonomer-Stammlösung vom Typ I vom Rind hergestellt. Lösungen wurden aus 10 % (v/v) 10× DMEM, 2,5 % (v/v) HEPES-Puffer, 2,5 % (v/v) Natriumbicarbonat und Wasser in Zellkulturqualität erzeugt. Dieses Verfahren wurde vollständig auf Eis bei 4 °C durchgeführt, um die Selbstorganisation von Kollagen zu verhindern. Der Lösung wurde Kollagen hinzugefügt, so dass eine endgültige Kollagen-I-Konzentration von 1 mg/ml erhalten wurde, und die Lösung wurde mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die Lösungen wurden 45 Minuten bis 1 Stunde lang bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid gelieren gelassen und anschließend mit Zellkultur-Wachstumsmedium überschichtet, um eine Dehydrierung des Gels zu verhindern. Gele mit fluoreszierend markiertem Kollagen I wurden auf die gleiche Weise erzeugt, mit der Ausnahme, dass fluoreszierend markierte Kollagenmonomere in einem Vol./Vol.-Verhältnis von 1:10 zu unmarkiertem Kollagen hinzugefügt wurden.

Nach der Zubereitung wurden die Lösungen in speziell angefertigte Kammern pipettiert. Diese Kammern wurden aus Zellkultureinsätzen konstruiert, wobei die Mitte entfernt wurde. Anschließend wurden die Zellkultureinsätze mithilfe des auf den Einsätzen vorhandenen Klebstoffs an Zellkulturschalen mit Deckglasboden befestigt. 150 μl Lösung wurden in jede Kammer pipettiert und die Kammern wurden schnell für 45 Minuten bis 1 Stunde auf 37 °C und 5 % Kohlendioxid überführt, um die Gelierung zu ermöglichen. Anschließend wurden die Gele mit 100 μl Zellkultur-Wachstumsmedium überschichtet und etwa 600 μl Wachstumsmedium in den Bereich um die Gele gegeben, um eine Austrocknung des Gels zu verhindern.

Kollagengele mit implantierten Sphäroiden wurden wie oben beschrieben hergestellt, wobei der Lösung vor der Gelierung einzelne Sphäroide zugesetzt wurden. Vor der Zugabe von Sphäroiden zur Lösung wurden die Sphäroide 45–60 Minuten lang in eiskalte Zellrückgewinnungslösung gelegt, um jegliches Matrigel von der Außenseite des Sphäroids zu entfernen, das sich während der Sphäroidbildung und -verdichtung angesammelt hatte. Während dieses Prozesses wurden Kollagenlösungen wie oben beschrieben hergestellt und gegossen, sodass nach der Behandlung mit Cell Recovery Solution ein einzelnes Sphäroid in jede einzelne Kollagenlösung gegeben werden konnte. Anschließend wurden die Lösungen wie oben beschrieben inkubiert und mit Wachstumskulturmedium überschichtet.

Wie in Abb. 1 und Abb. S1a schematisch dargestellt, beginnt das DISC-3D-Protokoll mit der Bildung von Sphäroiden durch Zentrifugieren von Zellen in Gegenwart von Basalmembranextrakt (Matrigel), wie oben beschrieben. Die Sphäroidlösung wird vor der Zentrifugation mit Nilrot-Fluorosphären (Polystyrol, 1 μm Durchmesser) ergänzt, die als visueller Hinweis für die Position des Sphäroids während des Kryoschnitts dienen. Die Fluorosphären haben keinen Einfluss auf die Invasionsfähigkeit der Zellen (Abb. S2). Nach der Zentrifugation werden die Sphäroide 48 Stunden lang kompaktiert und dann in 1 mg/ml Kollagen-I-Lösungen implantiert (Abb. S1a) und in einen Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 überführt, um die Kollagengelierung zu initiieren und die Zellgesundheit aufrechtzuerhalten .

Ab diesem Zeitpunkt verfügt das DISC-3D-Protokoll über drei parallele Probenvorbereitungspfade, die für unterschiedliche Experimente geeignet sind (Abb. S1b–d). In allen drei Ansätzen werden 10 % (w/v) Schweinegelatine vom Typ A verwendet, um ein sekundäres Netzwerk zu bilden. Die gesamte in dieser Arbeit verwendete Gelatine wird vor der Verwendung autoklaviert. Dies verringert das durchschnittliche Molekulargewicht der Gelatine und die Viskosität der Gelatinelösung, sodass die Lösung das Kollagennetzwerk leichter durchdringen kann. Nach dem Autoklavieren wurden die Gelatinelösungen vor der Zugabe zu den Proben bei 37 °C gelagert.

Um Proben für die Abbildung des Sphäroidkerns vorzubereiten, ließ man die Proben 1 Stunde lang bei 37 °C und 5 % CO2 gelieren, woraufhin sie fixiert und gefärbt wurden (Abb. S1b). Um Proben für die Abbildung des Sphäroidkerns und der eindringenden Zellen vorzubereiten, ließ man Sphäroide nach der Kollagen-I-Implantation 48 Stunden lang eindringen. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Proben fixiert und gefärbt (Abb. S1c). In beiden Fällen wurden die Proben nach der Färbung (beschrieben im Abschnitt „Immunzytochemie“ weiter unten) mit 75 μl PBS und 100 μl 10 %iger Gelatine überschichtet. Ungefähr 600 μl PBS wurden in den Bereich um die Gele gegeben, um eine Austrocknung des Gels zu verhindern. Nachdem die Probe mit Gelatine überschichtet worden war, wurde die Probe 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Probe wurde dann 1 Stunde lang bei 4 °C gehalten, um die Gelierung der Gelatine zu ermöglichen. Anschließend wurde die Probe in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert, bis sie kryogeschnitten wurde.

Invasive Sphäroide, die für die Massenspektrometrie-Bildgebung vorbereitet wurden, durften 24 Stunden lang eindringen. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Sphäroide mit 10 % (w/v) Schweinegelatine Typ A überschichtet. Die Proben wurden dann weitere 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, sodass die Zellen ungehindert weiterwandern konnten, während die Gelatine durch die Probe diffundierte (Abb . S2). Nach dieser Inkubationszeit wurden die Proben 1 Stunde lang bei 4 °C gekühlt, um die Gelierung der Gelatine zu ermöglichen. Anschließend wurde die Probe in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zum Kryoschnitt bei –80 °C gelagert.

Sobald zellfreie Kollagengele bei 37 °C (1 Stunde) vollständig geliert waren, wurden sie mit 75 μl PBS und 100 μl 10 %iger Gelatine überschichtet. Die Probe wurde dann 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, 1 Stunde lang bei 4 °C geliert, schockgefroren und bis zum Kryoschneiden bei –80 °C gelagert.

In diesem Stadium vorbereitete Proben sind in der Regel bis zu einem Monat haltbar, wenn sie in einem luftdichten Behälter bei –80 °C gelagert werden, und können bis zu 6 Monate lang verwendet werden. Längere Zeitskalen führen jedoch zu trockeneren Proben und daher zu einer erhöhten Probenrissbildung während Kryoschneiden.

Die Proben wurden in einem Kryostat Leica CM3050 S kryogeschnitten, wobei sowohl die Kammer als auch der Probenhalter bei –20 °C gehalten wurden. Temperaturen unter –20 °C führten tendenziell zu Rissen in der Probe, und Temperaturen über –20 °C erhöhten die Wahrscheinlichkeit, dass die Probe am Objekttisch anhaftet, was ein sauberes Schneiden verhindert. Vor dem Schneiden ließ man die Proben mindestens 20 Minuten lang auf –20 °C erwärmen, um ein Brechen zu verhindern. Die Zellkultur-Abstandshalter aus Silikon, die die gelierten Proben enthielten, wurden von der Zellkulturschale gelöst, indem die Probe vorsichtig von der Schale gekippt wurde, da das Herausziehen der Proben oft zu Rissen in der Probe führte. Anschließend wurden die Proben von den Silikonabstandshaltern entfernt und mit Wasser in Massenspektrometriequalität am Spannfutter befestigt.

Die Proben wurden so montiert, dass die Ausrichtung des Gels auf dem Spannfutter die Ausrichtung des Gels auf der Zellkulturschale nachahmte (dh der Boden des Gels bleibt in beiden Szenarien der Boden). Die Proben wurden auf den interessierenden Bereich zugeschnitten (ggf. unter Verwendung des visuellen Hinweises der Nilrot-Fluorosphären). Die Proben wurden dann auf die gewünschte Dicke geschnitten: 4 μm für reine Kollagengele und 10 μm für Kollagengele mit Sphäroiden. Kollagen-I-Scheiben neigten dazu, an Oberflächen zu haften und zu zerknittern, was die Verwendung des integrierten Rollschutzes am Kryostaten zu einer Herausforderung machte. Daher wurde das Rollen der Probe verhindert, indem die abgeschnittenen Scheiben vorsichtig mit einem Pinsel mit weicher Spitze von der Probe weggeführt wurden. Die Proben wurden dann auf die entsprechenden Glasobjektträger übertragen, wiederum mit einem Pinsel mit weicher Spitze (vorgereinigte Objektträger 24 × 75 × 1 mm für die Massenspektrometrie-Bildgebung, Deckglas 24 × 40 × 0,13–0,17 für die Mikroskopie-Bildgebung und 35 mm). Hochtoleranzschalen P35G-1.0-14-C für hochauflösende Mikroskopie). Nach dem Kryoschneiden können die Proben bis zur Verwendung in einem luftdichten Behälter bei −80 °C gelagert werden. Bisher wurde kein Probenabbau im Gefrierschrank bei −80 °C beobachtet, auch nicht bei Proben, die bis zu einem Jahr gelagert wurden. Sobald die Proben gebrauchsfertig sind, sollten sie in einem Trockenmittel unter Vakuum mindestens 10 Minuten lang getrocknet werden. Nach dem Trocknen können die Proben wie unten beschrieben weiter gefärbt und beschriftet werden.

Nach der Bildung und Implantation der Sphäroide wurden die Sphäroide zum Zeitpunkt 1 Stunde mit vorgewärmtem 4 %igem Formalin 20 Minuten lang fixiert. Anschließend wurden die Sphäroide dreimal 10 Minuten lang mit 1× PBS gespült. Als nächstes wurden die Sphäroide 10 Minuten lang in 0,02 % Triton-X-Lösung permeabilisiert, gefolgt von einem schnellen Spülen, zwei 10-minütigen Einweichen und einem 30-minütigen Einweichen, alles in 1× PBS. Anschließend wurden die Sphäroide wie unten beschrieben gefärbt und abgebildet.

Anti-β1-Integrin AlexaFluor488 (Klon P5D2) wurde in einer Konzentration von 1:200 (v/v) gefärbt, Phalloidin AlexaFluor 647 wurde in einer Konzentration von 1:1000 (v/v) gefärbt und DAPI in einer Konzentration von 1: 1000 (v/v). Die Proben wurden über Nacht im Dunkeln bei 4 °C gefärbt und anschließend dreimal 10 Minuten lang mit 1 × PBS gespült. Die Proben wurden mit 100 μl 1×-PBS überschichtet und dann (noch in 3D) auf dem Zeiss LSM800 mit einem 20×-Objektiv abgebildet. Z-Stapel wurden in Abständen von 10 μm aufgenommen, so hoch, wie es der Arbeitsabstand des Objektivs zuließ. Anschließend wurden die Proben mit Gelatine und PBS überschichtet, eingefroren und kryogeschnitten (DISC-3D-Protokoll Teil 2). Jede Schicht (typischerweise ≈ 50) des Sphäroids wurde auf dem Zeiss LSM800 mit dem 20-fach-Objektiv abgebildet. Jede dieser Scheiben wurde dann erneut mit den oben aufgeführten Farbstoffen und Konzentrationen gefärbt. Ungefähr 20 μl der Färbelösung wurden auf jede einzelne Scheibe des kryogeschnittenen Sphäroids gegeben, und die Proben wurden über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten und verschlossenen Kammer ruhen gelassen (um die Verdunstung der Färbelösung zu reduzieren). Die Proben wurden am nächsten Morgen dreimal 10 Minuten lang in 1 × PBS gespült, vollständig getrocknet und jede Schicht wurde erneut wie oben beschrieben abgebildet.

Sphäroide wurden mit Anti-β1-Integrin AlexaFluor488 (Klon P5D2) in einer Konzentration von 1:200 (v/v) und DAPI in einer Konzentration von 1:1000 (v/v) gefärbt. Die Proben wurden über Nacht im Dunkeln bei 4 °C gefärbt und anschließend dreimal 10 Minuten lang mit 1 × PBS gespült. Die Proben wurden mit Gelatine überschichtet und wie im DISC-3D-Protokoll Teil 2 beschrieben kryogeschnitten. Bilder der kryogeschnittenen Proben wurden mit dem Zeiss LSM800 unter Verwendung des 20-fach-Objektivs aufgenommen. Anschließend wurden die Proben 10 Monate lang in einer luftdichten, trockenen Box bei 4 °C gelagert. Die Probe wurde auf Raumtemperatur erwärmt und dann mit Phalloidin AlexaFluor 647 in einer Konzentration von 1:1000 (v/v) gefärbt. Der Farbstoff wurde in einer Menge von 20 μl pro kryogeschnittener Scheibe hinzugefügt und über Nacht in einer verschlossenen, befeuchteten Kammer bei 4 °C stehen gelassen. Anschließend wurde die Probe dreimal 5 Minuten lang in 1x PBS gewaschen. Nach dem Schneiden wurden alle Proben auf dem Zeiss LSM800 Airyscan auf dem 63-fachen Ölobjektiv abgebildet.

Proben invasiver Sphäroide (alle nach dem in Abb. S1c dargestellten DISC-3D-Protokoll hergestellt) wurden wie zuvor beschrieben erzeugt und nach 48 Stunden Invasion fixiert. Das Zellkultur-Wachstumsmedium wurde aus den Gelen entfernt. Die Gele wurden dann 20 Minuten lang unter Verwendung von vorgewärmtem 4 % methanolfreiem Formaldehyd in 1 × PBS 20 Minuten lang fixiert, gefolgt von drei 10-minütigen Spülungen mit PBS. Anschließend wurden die Proben 10 Minuten lang mit 0,02 % Triton-X in 1× PBS permeabilisiert. Dann wurde das Triton-X entfernt und die Proben schnell mit PBS gespült und dann zweimal 10 Minuten lang in 1× PBS gewaschen, gefolgt von einem 30-minütigen Einweichen in 1× PBS. Die Proben wurden dann wie unten beschrieben in 100 μl 1× PBS pro Kammer und über Nacht bei 4 °C gefärbt, sofern nicht anders angegeben. Nach der Färbung wurden die Proben dreimal 10 Minuten lang mit 1 × PBS gespült und mit 75 μl 1 × PBS überschichtet. Anschließend wurden die Proben mit Gelatine überschichtet und gemäß den oben beschriebenen Verfahren (DISC-3D-Protokoll Teil 2) kryogeschnitten. Nach dem Schneiden wurden alle Proben auf dem Zeiss LSM800 im Airyscan-Modus mit dem 63-fachen Ölobjektiv abgebildet.

Der direkt konjugierte Anti-RhoA-Antikörper wurde in einer Konzentration von 1:100 (v/v) und DAPI in einer Konzentration von 1:1000 (v/v) verwendet. Nach diesen Färbungen wurden die Proben dreimal 10 Minuten lang in 1 × PBS gewaschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einer 2%igen BSA-Lösung blockiert. Die Proben wurden anschließend mit einem sekundären Antikörper unter Verwendung eines mit ATTO 647 fluoreszenzmarkierten monoklonalen Maus-IgG in einer Konzentration von 1:100 v/v in einer 2 %igen BSA-Lösung bei Raumtemperatur eine Stunde lang gefärbt. Die Proben wurden dann wie in „Immunzytochemie und Markierung fixierter invasiver Sphäroide“ beschrieben behandelt.

Der direkt konjugierte Anti-p53-Antikörper wurde in einer Konzentration von 1:1 (v/v) verwendet, wobei DAPI in einer Konzentration von 1:1000 (v/v) zugesetzt wurde. Die Proben wurden dann dreimal 10 Minuten lang in 1 × PBS gewaschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einer 2%igen BSA-Lösung blockiert. Die Proben wurden anschließend mit einem sekundären Antikörper unter Verwendung eines mit ATTO 647 fluoreszenzmarkierten monoklonalen Maus-IgG in einer Konzentration von 1:100 v/v in einer 2 %igen BSA-Lösung bei Raumtemperatur eine Stunde lang gefärbt. Die Proben wurden dann wie in „Immunzytochemie und Markierung fixierter invasiver Sphäroide“ beschrieben behandelt.

MT-MMP-1 AlexaFluor 488-Antikörper wurde in einer Konzentration von 1:10 (v/v) aufgetragen und DAPI wurde in einer Konzentration von 1:1000 (v/v) gefärbt. Die Proben wurden dann wie in „Immunzytochemie und Markierung von“ beschrieben behandelt feste invasive Sphäroide“.

Die optische Mikroskopie wurde an einem von vier Mikroskopen durchgeführt. Für Abb. S2 wurde ein invertiertes konfokales Laser-Scanning-Mikroskop Olympus Fluoview 300 mit einem 10-fachen Luftobjektiv (NA 0,4) verwendet. Für die in Abb. 4a und Abb. S7 mit „konfokal“ gekennzeichneten Bilder wurde ein invertiertes konfokales Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss LSM700 mit einem 63-fachen Ölobjektiv (NA 1,4) verwendet. Für die Abbildungen wurde ein Zeiss LSM800 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop 63× Öl (NA 1,4) verwendet. 2a–c, 6 und Abb. S3. Für Abb. 3a wurde ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop LSM800 von Zeiss mit einem 10-fachen (NA 0,4) Objektiv verwendet, z. Für die Abbildungen wurde dasselbe Mikroskop im Airyscan-Modus mit einem 63-fachen Öl (NA 1,4) verwendet. 3b–d, f–h, 4a, S5 und S7 für Bilder mit der Bezeichnung „Airyscan“. Ein Zeiss Elyra 7 Mikroskop 63× Öl (NA 1,46) wurde je nach Bedarf für Abb. 4a und Abb. S7 entweder im Weitfeldmodus, im Gitter-SIM-Modus oder im STORM-Modus verwendet.

Airyscan-Bilder wurden mit einem inversen konfokalen Zeiss LSM800-Mikroskop mit einem 63-fachen Ölobjektiv (NA1,4) und einem GaAsP-PMT-Detektor aufgenommen. Es wurden optimale Einstellungen für Pixelgröße, Scangeschwindigkeit und Scanbereich verwendet, wie von der ZeissZen Blue-Software definiert. Nach der Bilderfassung wurden die Bilder mit dem Airyscan-Verarbeitungstool in der ZeissZen Blue-Software verarbeitet.

SIM-Bilder wurden mit einem Zeiss Elyra 7-Mikroskop mit Gitter-SIM unter Verwendung eines 63-fachen Ölobjektivs (NA 1,46), einer zusätzlichen 1,6-fachen Vergrößerungslinse und einer pco.edge 4,2 sCMOS-Kamera aufgenommen. Es wurden optimale Einstellungen für Gitter und Z-Stack-Auflösung verwendet, wie von der ZeissZen Black-Software definiert. SIM-Bilder wurden mit den Standardeinstellungen der ZeissZen Black-Software rekonstruiert.

Für die STORM-Bildgebung wurde der Bildgebungspuffer wie zuvor beschrieben hergestellt.61 Kurz gesagt, es wurde 1 M Tris-Puffer mit pH 8,0 hergestellt. Vectashield-Montagemedium H1000 wurde in 95 % (v/v) Glycerin verdünnt, um eine Endkonzentration von 25 % (v/v) Montagemedium zu ergeben. Tris-Puffer wurde hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 50 mM Tris im gesamten Bildgebungspuffer zu erreichen. STORM-Bilder wurden mit einem Zeiss Elyra 7 aufgenommen, der mit einem 63× 1,46 NA TIRF-Objektiv und einer pco.edge 4,2 sCMOS-Kamera ausgestattet war. Die Bilder wurden mit HILO-Beleuchtung aufgenommen. Die Proben wurden mit 100 % Laserleistung beleuchtet, um mit einem 561-nm-Laser (100 mW) ein Farbstoffblinken zu induzieren. Die Bilder wurden über 30.000 Bilder mit einer Belichtungszeit von 20 ms aufgenommen. STORM-Bilder wurden mit dem ThunderSTORM-Plugin in FIJI mit Standard-Analyseeinstellungen rekonstruiert. Die Kameraeinstellungen für die Rekonstruktion wurden gemäß den Herstellerangaben eingestellt [Pixelgröße = 97 nm, Photoelektronen pro A/D-Zählung = 0,46, Basisniveau (A/D-Zählungen) = 97]. Lokalisierte Moleküle in rekonstruierten Bildern wurden nach Intensität (> 100 Photonen) und Standardabweichung der angepassten Gaußschen Funktion (> 50 nm und < 250 nm) gefiltert, um Rauschen und Anpassungen schlechter Qualität zu entfernen. Das Rauschen wurde durch die Verwendung eines DBSCAN-basierten Filters zur Entfernung von Ausreißermolekülen in dünn besiedelten Bereichen des Bildbereichs (Epsilon = 50 nm, MinPts = 5) weiter reduziert. Nach diesen Nachbearbeitungsschritten wurden die Bilder mithilfe von Kreuzkorrelation mit einer Bin-Größe von 5 driftkorrigiert. Moleküle in nachbearbeiteten und driftkorrigierten Bildern wurden mithilfe des „Normalisierten Gaußschen“ Renderings mit einer auf 10 nm eingestellten lateralen Unsicherheit visualisiert .

Für die Massenspektrometrie-Bildgebung vorbereitete Sphäroide wurden geformt und wie oben beschrieben in Kollagengele implantiert, wobei dem in Abb. S1d dargestellten DISC-3D-Protokoll gefolgt wurde. Anschließend wurden die Proben in 10 μm dicke Scheiben kryogeschnitten und MSI-Bilder aufgenommen.

Die Schnitte wurden auf einem Prosolia Desorption Electrospray Ionization (DESI) 2D-Tisch abgebildet, der auf dem SYNAPT HDMS G2-Si Q-ToF-Massenspektrometer (Waters Corporation, Milford, MA, USA) montiert war. Das DESI war mit einem modifizierten Hochleistungszerstäuber von Waters und einem Prototyp einer beheizten Transferkapillare ausgestattet, um den Transfer der erzeugten Ionen zu optimieren (Abb. S6). Das Elektrospray-Lösungsmittel bestand aus Methanol/Wasser/Ameisensäure (98:2:0,01; v/v/v) mit 40 pg/µL Leucin-Enkephalin als interne Sperrmasse. Die Flussrate betrug 2 µL/min. Die Sprühkapillarspannung wurde auf 0,6 kV eingestellt, die Kegelspannung betrug 50 V und die Ionenquellentemperatur wurde auf 150 °C eingestellt. Massenspektren wurden im positiven und negativen Ionisationsmodus mit einem Massenbereich von m/z 50–1200 und einer Pixelgröße von 40 μm aufgenommen. Die beheizte Transferleitung wurde auf Temperaturen zwischen 24 und 400 °C eingestellt. Ionenbild-Massenspektraldaten (entsprechende m/z-Merkmale in jedem Pixel innerhalb des Bildes) von DESI MSI wurden zur Visualisierung mit der Software High Definition Imaging (HDI Version 1.6, Waters Corporation) verarbeitet. Alle Bilder wurden auf den Gesamtionenstrom normiert. Die Lipidionen wurden annotiert, indem monoisotopische Massen anhand der verfügbaren Online-Datenbanken Lipid MAPS mit einer Massentoleranz von 5 ppm abgeglichen und die Driftzeiten mit den verfügbaren Standards abgeglichen wurden.

Eine korrelative Bildgebung über optische Mikroskopietechniken hinweg wurde an zellfreien Hydrogelen durchgeführt, die wie oben beschrieben mit dem DISC-3D-Protokoll aufgenommen wurden (Abb. S7). Die Proben wurden der Reihe nach auf dem Zeiss LSM700 (konfokal), dem Zeiss LSM800 im Airyscan-Modus, dem Zeiss Elyra SIM und schließlich dem Zeiss Elyra STORM abgebildet. Die gesamte Bildkorrelation wurde mit dem FIJI-Plugin TurboReg62 durchgeführt.

Sphäroide, die sowohl für die Massenspektrometrie-Bildgebung als auch für die konfokale Mikroskopie vorbereitet wurden, wurden wie zuvor beschrieben erzeugt und implantiert (Abb. S1d) und wie im DISC-3D-Protokoll Teil 2 beschrieben kryogeschnitten. Nach dem Kryoschneiden und der DESI-MSI-Erfassung wurden die Sphäroide mit 4 % Formalin fixiert für 10 Minuten, gefolgt von drei 5-minütigen Waschgängen mit 1× PBS. Anschließend wurde die Probe mit DAPI in einer Konzentration von 1:1000 (v/v) in 1× PBS gefärbt. Ungefähr 20 μl der Farbstofflösung wurden auf jede kryogeschnittene Scheibe gegeben. Die Proben wurden über Nacht im Dunkeln bei 4 °C in einer verschlossenen, feuchten Kammer gefärbt. Anschließend wurden die Proben dreimal für 5 Minuten in 1 × PBS gespült. Sphäroidschnitte wurden auf dem Zeiss LSM800-Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung abgebildet. Die Bildkorrelation wurde mit dem FIJI TurboReg-Registrierungs-Plugin durchgeführt.

Alle statistischen Tests wurden mit einem α-Wert von 0,05 durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde mit Sternchen gekennzeichnet, wobei * für ap < 0,05, ** für ap < 0,01 und *** für ap < 0,001 steht. Ein Mangel an statistischer Signifikanz (p > 0,05) wird durch einen Dolch (†) gekennzeichnet. A bezeichnet die statistische Signifikanz und wird bei Verwendung in der entsprechenden Bildunterschrift beschrieben.

Sphäroidinvasive Abstände (Abb. S2) wurden anhand von 10-fach-Bildern bestimmt, die mit dem Olympus Fluoview 300 im Scan-Transmissionsmodus bei t = 1 Stunde und t = 48 Stunden nach der Implantation der Sphäroide aufgenommen wurden. Die invasive Distanz wurde als der Umfang eines Kreises definiert, der bei t = 48 h mindestens 90 % der invasiven Vorderseite des Sphäroids umfasst, abzüglich des Umfangs eines Kreises, der den Sphäroidkern bei t = 1 h vollständig umfasst.

Die Fluoreszenzintensität über dem Sphäroid in 3D-, kryogeschnittenen und kryogeschnittenen und erneut gefärbten Sphäroiden (Abb. 2) wurde in FIJI durch Zeichnen einer Linie berechnet, die das Sphäroid halbiert. Das Intensitätsprofil entlang dieser Linie wurde auf die maximale Intensität entlang dieser Linie normalisiert und aufgetragen. Die normalisierte Signalintensität wurde für jede verfügbare abgebildete Schicht berechnet – 12 Schichten für die 3D-Probe, 56 Schichten für die DISC-3D-Proben und 49 Schichten für erneut gefärbte DISC-3D-Proben. Die durchschnittliche Intensität für jede Schicht wurde bestimmt und als Box- und Whisker-Diagramm dargestellt (Abb. 2i – k).

Die Signal-Hintergrund-Verhältnisse von 3D- und Kryoschnittbildern (Abb. 3) wurden bestimmt, indem die maximale Intensität der interessierenden Regionen, die Zellen umfassen (oder die lokale extrazelluläre Umgebung im Fall von MT1-MMP), durch die maximale Intensität der Regionen außerhalb der Zellen dividiert wurde und/oder die lokale extrazelluläre Umgebung.

Um die scheinbare Kollagenfaserbreite zu bestimmen (Abb. 4b), wurden ROIs über Kollagenfasern senkrecht zur längsten Abmessung der Faser gezogen. Pixelintensitätswerte wurden entlang des ROI aufgezeichnet und das Intensitätsprofil wurde an eine Gaußsche Funktion der Form angepasst:

Alle Anpassungen mit einem angepassten R2-Wert unter 0,95 wurden verworfen, bevor eine weitere Analyse durchgeführt wurde. Die Halbwertsbreite (FWHM) dieser Kurven wurde extrahiert und der Mittelwert definierte die scheinbare Faserbreite.

Die Bestimmung der Auflösung von Weitfeld-, Konfokal-, Airyscan- und SIM-Mikroskopien erfolgte durch Messung der Halbwertsbreite (FWHM) der Punktspreizfunktion einer Punktquelle. Konkret wurden TetraSpeck-Perlen (100 nm) auf Glas abgeschieden, das zunächst 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,01 % Poly-L-Lysin beschichtet wurde. Die Poly-L-Lysin-Lösung wurde entfernt und der Glasobjektträger wurde trocknen gelassen. Die Perlen wurden 1:200 in dIH2O verdünnt, 5 Minuten lang beschallt und dann gevortext. Die Perlenlösung wurde auf den Glasobjektträger gegeben und 10 Minuten lang stehengelassen. Überschüssige Lösung wurde entfernt und die Kügelchen wurden mit den jeweiligen Mikroskopiemethoden in Konfigurationen abgebildet, die denjenigen widerspiegelten, die für die Abbildung von Kollagenfasern verwendet wurden. Die FWHM der Punktausbreitungsfunktion der Kügelchen mit jeder dieser Techniken wurde auf die gleiche Weise bestimmt, wie die Kollagen-I-Faserbreiten bestimmt wurden. Kurz gesagt, ROIs wurden über die Mitte der Perle gezeichnet und die Intensität über den ROI wurde an eine Gaußsche Kurve angepasst. Die FWHM der Kurve definierte die Auflösung und die minimal erwartete Faserbreite, die mit jeder Technik verbunden ist.

Die Auflösung der STORM-Bildgebung wurde bestimmt mit:

wie in Ref.53 beschrieben. Die Lokalisierungsgenauigkeit wurde im FIJI-Plugin ThunderSTORM gemäß dem in Ref.63 beschriebenen Protokoll berechnet. Die Nyquist-Auflösung wurde mithilfe des in Ref. 64 beschriebenen Protokolls berechnet, das die Bildauflösung mit der Lokalisierungsdichte des Bildes in Beziehung setzt. Abb. S4d zeigt die Änderung der Auflösung und der scheinbaren Kollagenfaserbreite (unter Verwendung der oben beschriebenen Methode) als Funktion der Anzahl der in die Analyse einbezogenen Bilder. Beide Größen nähern sich dem Plateau um etwa 20.000 Bilder, was die Wahl von 30.000 Bildern als Zahl für die STORM-Bildgebung und deren Analyse unterstützt.

Die Porengröße wurde mit der in Ref. 65 beschriebenen Methode bestimmt. Um mögliche Verzerrungen zu reduzieren, wurde für alle Bildgebungskontexte derselbe Bildverarbeitungsworkflow verwendet (über alle Mikroskopietechniken und 3D hoch/niedrig vs. DISC-3D). In ImageJ wurden Rohbilder einem Bandpassfilter und einer Rolling-Ball-Hintergrundsubtraktion unterzogen, um Merkmale unterhalb eines bestimmten Größenschwellenwerts zu entfernen bzw. das Hintergrundsignal außerhalb der Ebene zu reduzieren. Anschließend wurden die Bilder einem automatischen lokalen Schwellenwert unterzogen, um ein binarisiertes Bild zu erhalten. Um die Porengröße zu bestimmen, wurden die Abstände zwischen „Ein“-Pixeln Zeile für Zeile und Spalte für Spalte im segmentierten Bild gezählt. Die Verteilung dieser Lücken zwischen Fasern wurde an die exponentielle Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion angepasst:

Die für das Netzwerk angegebene Porengröße ist die charakteristische Porengröße 1/λ.

Daten werden auf Anfrage zur Verfügung gestellt.

Duval, K. et al. Modellierung physiologischer Ereignisse in 2D- und 3D-Zellkulturen. Physiology 32, 266–277 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maltman, DJ & Przyborski, SA Entwicklungen in der dreidimensionalen Zellkulturtechnologie mit dem Ziel, die Genauigkeit von In-vitro-Analysen zu verbessern. Biochem. Soc. Trans. 38, 1072–1075 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jensen, C. & Teng, Y. Ist es an der Zeit, mit dem Übergang von der 2D- zur 3D-Zellkultur zu beginnen? Vorderseite. Mol. Biowissenschaften. 7, 33 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kapałczyńska, M. et al. 2D- und 3D-Zellkulturen – Ein Vergleich verschiedener Arten von Krebszellkulturen. Bogen. Med. Wissenschaft. 14, 910–919 (2016).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C. & de Boer, J. Sphäroidkultur als Werkzeug zur Erzeugung komplexer 3D-Gewebe. Trends Biotechnologie. 31, 108–115 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Costa, EC et al. 3D-Tumorsphäroide: Ein Überblick über die für ihre Analyse verwendeten Werkzeuge und Techniken. Biotechnologie. Adv. 34, 1427–1441 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Boyd, NF et al. Mammographische Dichte und das Risiko und die Erkennung von Brustkrebs. N. engl. J. Med. 356, 227–236 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Boyd, NF, Martin, LJ, Yaffe, MJ & Minkin, S. Mammographische Dichte und Brustkrebsrisiko: Aktuelles Verständnis und Zukunftsaussichten. Brustkrebs Res. 13, 223 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Conklin, MW et al. Ausgerichtetes Kollagen ist eine prognostische Signatur für das Überleben beim menschlichen Brustkarzinom. Bin. J. Pathol. 178, 1221–1232 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Apte, MV et al. Desmoplastische Reaktion bei Bauchspeicheldrüsenkrebs: Rolle der Bauchspeicheldrüsen-Sternzellen. Pankreas 29, 179–187 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pothula, SP et al. Targeting der HGF/c-MET-Achse bei Bauchspeicheldrüsenkrebs. Int. J. Mol. Wissenschaft. 21, 9170 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, S. et al. Die Rolle von Kollagen bei Krebs: Von der Bank bis zum Krankenbett. J. Übers. Med. 17, 309 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Guzman, A., Ziperstein, MJ & Kaufman, LJ Die Wirkung der fibrillären Matrixarchitektur auf die Tumorzellinvasion in körperlich anspruchsvollen Umgebungen. Biomaterialien 35, 6954–6963 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, YL, Motte, S. & Kaufman, LJ Kollagengele vom Typ I mit variabler Porengröße und ihre Wechselwirkung mit Gliomzellen. Biomaterialien 31, 5678–5688 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sapudom, J. et al. Der Phänotyp der Krebszellinvasion wird durch den Fibrillendurchmesser und die Porengröße von 3D-Kollagennetzwerken gesteuert. Biomaterialien 52, 367–375 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hayn, A., Fischer, T. & Mierke, CT Inhomogenitäten in 3D-Kollagenmatrizen wirken sich auf die Matrixmechanik und die Migration von Krebszellen aus. Vorderseite. Zellentwickler. Biol. 8, 593879 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rao, SS et al. Inhärente mechanische Grenzflächengradienten in 3D-Hydrogelen beeinflussen das Verhalten von Tumorzellen. PLoS ONE 7, e35852 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kurz, AR et al. Abbildung von Zell-Matrix-Wechselwirkungen in 3D-Kollagen-Hydrogel-Kultursystemen. Makromol. Biowissenschaften. 17, 1600478 (2017).

Artikel Google Scholar

Jimenez Valencia, AM et al. Kollektive Invasion von Krebszellen, hervorgerufen durch koordinierte kontraktile Belastungen. Oncotarget 6, 43438 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Wang, Y. & Hummon, AB MS-Bildgebung von mehrzelligen Tumorsphäroiden und Organoiden als neues Werkzeug für personalisierte Medizin und Arzneimittelentwicklung. J. Biol. Chem. 297, 101139 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Xie, P. et al. Vorbereitung von mit Eis beschichteten Gefrierschnitten mehrzelliger Tumorsphäroide für die massenspektrometrische Bildgebung. Anal. Chem. 92, 7413–7418 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mittal, P. et al. Matrixunterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung (MALDI MSI) zur Überwachung der Arzneimittelreaktion in primären Krebssphäroiden. Proteomics 19, e1900146 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Chen, Y. et al. Die massenspektrometrische Bildgebung zeigte Veränderungen der Lipidmetaboliten in mehrzelligen Tumorsphäroiden als Reaktion auf Hydroxychloroquin. Anal. Chim. Acta 1184, 339011 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cabán-Rivera, J. et al. Erstellung formalinfixierter, in Paraffin eingebetteter 3D-Lungenkrebs-Zellsphäroide zur Optimierung immunhistochemischer Färbeverfahren. Methoden Mol. Biol. 2279, 59–73 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hira, VVV et al. Vergleich verschiedener Methoden und Kryostat- versus Paraffinschnitte für die chromogene Immunhistochemie. Acta Histochem. 121, 125–134 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ruan, JL et al. Eine verbesserte Kryoschnittmethode für Polyethylenglykol-Hydrogele, die im Tissue Engineering verwendet werden. Gewebe-Ing. Teil C Methoden 19, 794–801 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Berry, KAZ et al. MALDI-Bildgebungs-MS von Phospholipiden in der Mauslunge[S]. J. Lipid Res. 52, 1551–1560 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwartz, SA, Reyzer, ML & Caprioli, RM Direkte Gewebeanalyse mittels Matrix-unterstützter Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie: Praktische Aspekte der Probenvorbereitung. J. Massenspektrometer. 38, 699–708 (2003).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Nilsson, A. et al. Massenspektrometrische Bildgebung in der Arzneimittelentwicklung. Anal. Chem. 87, 1437–1455 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Maneta-Peyret, LCP, Moreau, P., Goffinet, G. & Cassagne, C. Immunzytochemie von Lipiden: Chemische Fixiermittel haben dramatische Auswirkungen auf die Erhaltung von Gewebelipiden. Histochem. J. 31, 541–547 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kotnala, A. et al. Auswirkungen der Gewebefixierung auf die Lipidanalyse der menschlichen Netzhaut mittels MALDI-Bildgebung und LC-MS/MS-Technologien. J. Massenspektrometer. 56, e4798 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ivascu, A. & Kubbies, M. Schnelle Erzeugung von Einzeltumor-Sphäroiden für die Zellfunktions- und Toxizitätsanalyse mit hohem Durchsatz. J. Biomol. Bildschirm. 11, 922–932 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Devanny, AJ, Vancura, MB & Kaufman, LJ Nutzung unterschiedlicher Effekte der Actomyosin-Kontraktilität zur Steuerung der Zellsortierung zwischen Brustkrebszellen. Mol. Biol. Zelle 32, AR24 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smyrek, I. & Stelzer, EH Quantitative dreidimensionale Auswertung der Immunfluoreszenzfärbung für große Ganzkörpersphäroide mit Lichtblattmikroskopie. Biomed. Opt. Exp. 8, 484–499 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Weiswald, LGJ, Richon, S., Bellet, D., Saubamea, B. & Dangles-Marie, V. In-situ-Proteinexpression in Tumorsphären, Entwicklung eines Immunfärbungsprotokolls für die konfokale Mikroskopie. BMC Cancer 10, 106 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Michaelson, DSJ, Murphy, G., D'Eustachio, P., Rush, M. & Philliprs, MR Differenzielle Lokalisierung von Rho-GTPasen in lebenden Zellen: Regulierung hyperviabler Regionen und RhoGDI-Bindung. J. Cell Biol. 152, 111–126 (2001).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pertz, O., Hodgson, L., Klemke, RL & Hahn, KM Raumzeitliche Dynamik der RhoA-Aktivität in wandernden Zellen. Natur 440, 1069–1072 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Krüger, T. & Scheer, U. p53 lokalisiert sich in intranukleolären Regionen, die sich von den Ribosomenproduktionskompartimenten unterscheiden. J. Cell Sci. 123, 1203–1208 (2010).

Artikel PubMed Google Scholar

Hakulinen, J., Sankkila, L., Sugiyama, N., Lehti, K. & Keski-Oja, J. Sekretion der aktiven Membran-Typ-1-Matrix-Metalloproteinase (MMP-14) in den extrazellulären Raum in mikrovesikulären Exosomen. J. Zelle. Biochem. 105, 1211–1218 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sanderson, RD, Bandari, SK & Vlodavsky, I. Proteasen und Glykosidasen auf der Oberfläche von Exosomen: Neu entdeckte Mechanismen für den extrazellulären Umbau. Matrix Biol. 75–76, 160–169 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Wu, X. & Hammer, JA ZEISS Airyscan: Optimierung der Nutzung für schnelle, schonende und hochauflösende Bildgebung. Methoden Mol. Biol. 2304, 111–130 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, BC et al. Gitterlichtblattmikroskopie: Abbildung von Molekülen auf Embryonen mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung. Science 346, 1257998 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, B., Bates, M. & Zhuang, X. Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie. Annu. Rev. Biochem. 78, 993–1016 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tokunaga, MIN & Sakata-Sogawa, K. Eine stark geneigte, dünne Beleuchtung ermöglicht eine klare Einzelmoleküldarstellung in Zellen. Nat. Methoden 5, 159–161 (2007).

Artikel Google Scholar

Yang, YL, Leone, LM & Kaufman, LJ Elastizitätsmodule von Kollagengelen können anhand der zweidimensionalen konfokalen Mikroskopie vorhergesagt werden. Biophys. J. 97, 2051–2060 (2009).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bazaid, A. et al. Zerstörungsfreie Bestimmung der Kollagenfibrillenbreite in extrudierten Kollagenfasern mittels Piezoreaktionskraftmikroskopie. Biomed. Physik. Ing. Exp. 3, 055004 (2017).

Artikel Google Scholar

Mickel, W. et al. Robuste Porengrößenanalyse filamentöser Netzwerke mittels dreidimensionaler konfokaler Mikroskopie. Biophys. J. 95, 6072–6080 (2008).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jawerth, LM, Münster, S., Vader, DA, Fabry, B. & Weitz, DA Ein blinder Fleck in der konfokalen Reflexionsmikroskopie: Die Abhängigkeit der Faserhelligkeit von der Faserorientierung in bildgebenden Biopolymernetzwerken. Biophys. J. 98, L1–L3 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Popkova, Y. et al. Ernährungsabhängige Veränderungen der Fettgewebezusammensetzung von Mäusen, überwacht durch NMR-, MS- und chromatographische Methoden. Anal. Bioanal. Chem. 407, 5113–5123 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Eberlin, LS, Ferreira, CR, Dill, AL, Ifa, DR & Cooks, RG Desorptions-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie zur Lipidcharakterisierung und biologischen Gewebebildgebung. Biochim. Biophys. Acta 1811, 946–960 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Silva, AAR et al. Plattformübergreifende Untersuchung von Plasma- und Gewebelipidsignaturen von Brustkrebs mithilfe von Massenspektrometrie-Tools. Int. J. Mol. Wissenschaft. 21, 3611 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, S. et al. Matrixunterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung von Zellkulturen zur Lipidomanalyse potenzieller Lipidmarker bei der Invasion menschlicher Brustkrebsarten. Schnelle Kommuni. Massenspektrometer. 30, 533–542 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Vidavsky, N. et al. Kartierung und Profilierung der Lipidverteilung in einem 3D-Modell des Fortschreitens von Brustkrebs. ACS Cent. Wissenschaft. 5, 768–780 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chughtai, K. et al. Referenzmarker für die kombinierte dreidimensionale massenspektrometrische und optische Gewebebildgebung. Anal. Chem. 84, 1817–1823 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ahlf, DR, Masyuko, RN, Hummon, AB & Bohn, PW Korrelierte Massenspektrometrie-Bildgebung und konfokale Raman-Mikroskopie für Untersuchungen dreidimensionaler Zellkulturschnitte. Analyst 139, 4578–4585 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Deininger, SO et al. Normalisierung in MALDI-TOF-Bildgebungsdatensätzen von Proteinen: Praktische Überlegungen. Anal. Bioanal. Chem. 401, 167–181 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Knizner, KT et al. Normalisierungstechniken für Hochdurchsatz-Screening mittels Infrarot-Matrix-unterstützter Laserdesorptions-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie. J. Massenspektrometer. 57, e4869 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tu, A. & Muddiman, DC Systematische Bewertung der Wiederholbarkeit von IR-MALDESI-MS und Normalisierungsstrategien zur Korrektur der analytischen Variation und Verbesserung der Bildqualität. Anal. Bioanal. Chem. 411, 5729–5743 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kalia, JRRT Fortschritte in der Biokonjugation. Curr. Org. Chem. 14, 138–147 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stephanopoulos, N. & Francis, MB Auswahl einer effektiven Protein-Biokonjugationsstrategie. Nat. Chem. Biol. 7, 876–884 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Olivier, N., Keller, D., Rajan, VS, Gonczy, P. & Manley, S. Einfache Puffer für die 3D-STORM-Mikroskopie. Biomed. Opt. Exp. 4, 885–899 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Hamel, V. et al. Korrelative mehrfarbige 3D-SIM- und STORM-Mikroskopie. Biomed. Opt. Exp. 5, 3326–3336 (2014).

Artikel Google Scholar

Thompson, REL & Webb, WW Präzise Nanometer-Lokalisierungsanalyse für einzelne Fluoreszenzsonden. Biophys. J. 82, 2775–2783 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jones, SA, Shim, SH, He, J. & Zhuang, X. Schnelle, dreidimensionale hochauflösende Bildgebung lebender Zellen. Nat. Methoden 8, 499–508 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaufman, LJ et al. Gliomaxpansion in Kollagen-I-Matrizen: Analyse von Kollagenkonzentrations-abhängigen Wachstums- und Motilitätsmustern. Biophys. J. 89, 635–650 (2005).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Dr. Gregory Roman und Dr. Roy Martin (Waters Corporation) für die Bereitstellung des Prototyp-Sprühers und des beheizten Übertragungsrohrs. Die Autoren danken dem Herbert Irving Comprehensive Cancer Center (P30CA013696) für den Joint Pilot Award, der diese Arbeit teilweise finanziert hat. Die Autoren würdigen die Verwendung von Instrumenten in der Imaging Facility im Department of Biological Sciences der Columbia University sowie in der Precision Biomolecular Characterization Facility und der Mass Spectrometry Core Facility im Department of Chemistry der Columbia University.

Fakultät für Chemie, Columbia University, New York, NY, 10027, USA

Rachel C. Avard, Megan L. Broad, Fereshteh Zandkarimi, Alexander J. Devanny, Joseph L. Hammer, Karen Yu und Laura J. Kaufman

Fakultät für Chemie, Cardiff University, Cardiff, CF10 3AT, Wales, Großbritannien

Megan L. Broad

Fachbereich Physik, Columbia University, New York, NY, 10027, USA

Karen Yu

Department of Biological Sciences, Columbia University, New York, NY, 10027, USA

Asja Guzman

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

RCA: Projektverwaltung, Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf. MLB: Untersuchung, formale Analyse, Visualisierung. FZ: Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf. AJD: Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Visualisierung, Software, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. JLH: Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Visualisierung, Software. KY: Untersuchung. AG: Konzeptualisierung. LJK: Aufsicht, Projektverwaltung, Konzeptualisierung, Finanzierungsbeschaffung, Methodik, Ressourcen, Schreiben – Originalentwurf, Überprüfung und Bearbeitung.

Korrespondenz mit Laura J. Kaufman.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Avard, RC, Broad, ML, Zandkarimi, F. et al. DISC-3D: Dual-Hydrogel-System verbessert die optische Bildgebung und ermöglicht die korrelative Massenspektrometrie-Bildgebung eindringender mehrzelliger Tumorsphäroide. Sci Rep 13, 12383 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38699-1

Zitat herunterladen

Eingegangen: 17. April 2023

Angenommen: 13. Juli 2023

Veröffentlicht: 31. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38699-1

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.